Fluorestsents

Allikas: Vikipeedia
Fluorestseeruv orgaaniline ühend nimega eskuliin

Fluorestsents (sõna tuleneb mineraalist fluoriit; seda mineraali uurides avastati fluorestsents[1]) on valguse kiirgumine ainest, mis on eelnevalt ergastatud UV-kiirgusega või nähtava valgusega.[2] See on luminestsentsi alaliik. Enamikul juhtudel omab emiteeruv kiirgus pikemat lainepikkust kui neelatav kiirgus ja seeläbi omab ka madalamat energiat. Samas, kui neelatav elektromagnetiline kiirgus on väga intensiivne, võib üks elektron neelata ka kaks footonit. Selline nähtus võib esile kutsuda fluorestsentsi, millel on lühem lainepikkus kui neelatud kiirgusel.

Fluorestsentsil on palju rakendusi, muu hulgas kasutatakse seda ka mineraloogias, spektroskoopias, metallide määramisel, keskkonna ja tervisekaitse analüüsides, värvides, fluorestsentslampides, bioaktiivsete ainete määramisel, immunoanalüüsides.

Ajalugu[muuda | redigeeri lähteteksti]

Ühe esimestest varajastest tähelepanekutest fluorestsentsi olemasolu kohta tegi 1565. aastal Nicolás Monardes, kui ta uuris ühe Kesk-Ameerikast pärit puidu (Lignum nephriticum) leotist [3]. Selle fluorestsentsi põhjustas keemiline ühend, mis on ühe selles puus leiduva flavonoidi redoksreaktsiooni produkt.[4]

1819. kirjeldas Edward D. Clarke ja 1822. René Just Haüy fluorestsentsi fluoriidis, 1833. kirjeldas Sir David Brewster seda fenomeni klorofüllis ja 1845. Sir John Herschel hiniinis.

1852. aastal kirjutas George Gabriel Stokes oma artiklis fluoriidist ja uraaniklaasist, mida ta kirjeldas kui materjale võimega muuta nähtamatut ultraviolettkiirgust nähtavaks pikema lainepikkusega kiirguseks. Ta nimetas seda fenomeni fluorestsentsiks.[5] Nime tuletas ta fluoriidist. Oma põhikatses kasutas ta prismat ultraviolettkiirguse eraldamiseks päikesekiirgusest, kiiritas sellega hiniini etanoolilahust ja täheldas selle tagajärjel sinist valgust.

Võrrandid[muuda | redigeeri lähteteksti]

Fotokeemia[muuda | redigeeri lähteteksti]

Fluorestsents toimub, kui pärast kõrgemale energianivoole ergastamist emiteerib elektron valgusefootoni ja seeläbi relakseerub oma põhiolekusse.

Ergastus:  S_0 + h \nu_{erg} \to S_1

Fluorestsents (kiirgumine):  S_1 \to S_0 + h \nu_{em} + soojus

Hiniini fluorestsentsi kustutamine kloriidioonide toimel. Vasakus klaasis on hiniinilahus koos naatriumkloriidiga ja paremas klaasis on hiniinilahus puhtalt.

 h\nu on footoni energia üldtuntud tähistus, kus h on Plancki konstant ja ν on valguse sagedus. Olekut S0 nimetatakse fluorofoori põhiolekuks ja S1 on tema esimene elektroonse ergastuse tase. Molekul võib oma ergastatud olekust relakseeruda mitme erineva omavahel konkureeriva viisiga:

  • Soojuslik üleminek põhiolekusse S0, kus energia vabaneb soojusena.
  • Intersüsteemne üleminek tripletsesse olekusse ja sealt edasi kiirguslik üleminek põhiolekusse. Seda nimetatakse fosforestsentsiks. Ka tripletsest olekust võib toimuda kiirguseta soojuslik üleminek põhiolekusse S0.
  • Fluorestsents, kus toimub kiirguslik üleminek põhiolekusse S0.

S1 olekust relakseerumine võib toimuda ka teise molekuliga vastastikmõju toimel, mida nimetatakse fluorestsentsi kustutamiseks. Näiteks molekulaarne hapnik (O2) on väga tugev ja efektiivne fluorestsentsi kustutaja oma ebatavalise tripletse põhioleku tõttu. Ergastatud molekulid võivad oma energia üle kanda ka mõnele teisele tundlikuks muudetud molekulile, mis ise seeläbi ergastub ja fluorestseerub.

Kvantsaagis[muuda | redigeeri lähteteksti]

Fluorestsentsi kvantsaagis näitab fluorestsentsi efektiivsust. Seda väljendatakse emiteerunud footonite ja neelatud footonite arvuhulkade suhtega.

 \Phi = \frac {\textrm{Emiteerunud\ footonite\ arv}} {\textrm{Neelatud\ footonite\ arv}}

Maksimaalne fluorestsentsi kvantsaagis võib olla 1,0 (100%); iga neeldunud footon ka kiiratakse. Ka ühendid, mille fluorestseerumise kvantsaagis on 0,1, loetakse üsna fluorestseeruvate ühendite alla. Teine võimalus, kuidas defineerida fluorestsentsi kvantsaagist, on kiirgusliku relakseerumise ja kõikide relakseerumisviiside kiiruskonstantide suhte abil.

 \Phi = \frac{ { k}_{ f} }{ \sum_{i}{ k}_{i } }

kus { k}_{ f} fluorestsentskiirguse kiiruskonstant ja

 \sum_{i}{ k}_{i }

on kõikide võimalike relakseerumisprotsesside kiirguskonstantide summa. Teised relakseerumisprotsessid on põhjustatud protsessidest, mis ei sisalda footoni kiirgamist, ja on seetõttu kutsutud mittekiirguslikeks üleminekuteks. Kui ükskõik millise ülemineku kiirus muutub, siis nii ergastatud oleku eluiga kui ka fluorestsentsi kvantsaagis on mõjutatud.[2] Fluorestsentsi kvantsaagist mõõdetakse standardiga võrreldes. Tavapärane fluorestsentsi standard on hiniinsulfaat väävelhappes.

Eluiga[muuda | redigeeri lähteteksti]

Fluorestsentsi eluiga näitab keskmiselt, kui kaua on molekul ergastatud olekus enne footoni kiirgamist. Tavaliselt järgib fluorestsents esimest järku reaktsioonikineetikat.

 \left[S 1 \right] = \left[S 1 \right]_0 e^{-\Gamma t}

kus \left[S 1 \right] on ajahetkel t ergastatud olekus molekulide kontsentratsioon, \left[S 1 \right]_0 on algkontsentratsioon ja \Gamma on relakseerumise kiirus või ümberpööratud fluorestsentsi eluiga. Tegemist on eksponentsiaalse kahanemisega. Ka mittekiirguslikud protsessid võivad ergastatud olekus olevate elektronide arvu kahandada. Sellisel juhul on fluorestsentsi kustumise kiirus kõikide relakseerumisprotsesside kiiruste summa:

 \Gamma_{kogu}=\Gamma_{kiirguslik} + \Gamma_{mittekiirguslik}

kus \Gamma_{kogu} on täielik kustumise kiirus ja \Gamma_{mittekiirguslik} on mittekiirgusliku kustumise kiirus. Kui mõne relakseerumisprotsessi kiirus on suur, siis fluorestsentsi eluiga on lühike. Enamkasutatavamate fluorestsentsühendite puhul on tavaline fluorestsentsi eluiga 0,5–20 nanosekundit. Fluorestsentsi eluiga on tähtis parameeter praktiliste rakenduste juures, nagu näiteks Försteri resonantsenergia ülekandes.

Varustus[muuda | redigeeri lähteteksti]

Fluorestsentsspektroskoopia aparatuur vajab esmalt kiirgusallikat, mis suudab emiteerida kiirgust mitmel lainepikkusel. Tavaliselt on analüüsiks vaja ühte kindlat lainepikkust, mis selekteeritakse välja filtri või monokromaatoriga. Seejärel läbib see kindla lainepikkusega valguskiir proovi. Pärast neeldumist ja taaskiirgumist võivad ilmenda mitmed lainepikkused Stokesi nihke ja mitmete teiste põhjuste tõttu. Et need lainepikkused eraldada ja analüüsida, on vaja veel ühte monokromaatorit. Teine monokromaator aga ei ole prooviküveti ja esimese monokromaatoriga sirge peal, vaid nende vahel on nurk. See on vajalik selleks, et ergastav kiirgus ei jõuaks teise monokromaatorini ja ei muudaks seeläbi analüüsi tulemusi. Pärast teist monokromaatorit jõuab kiirgus detektorisse.

Ühendite struktuur[muuda | redigeeri lähteteksti]

Fluoreen
Bifenüül

Kõige intensiivsem fluorestsents ilmneb ühendites, mis sisaldavad aromaatseid tuumi madalate üleminekute energiatega. Ka ühendid, mis omavad alifaatseid ja alitsüklilisi süsinikstruktuure või konjugeeritud kaksiksidemeid, võivad fluorestseeruda, aga nende kiirgumise intensiivsus on palju madalam kui aromaatsetel ühenditel. Aromaatsete ühendite kvantsaagis tavaliselt suureneb aromaatsete tuumade arvu suurenemisega. Lihtsamad heteroaatomilised ühendid, nagu furaan ja püridiin, ei oma fluorestseeruvaid omadusi, kuid mitmetuumalised ühendid, nagu näiteks indool ja kinoliin, juba enamasti omavad. Lisaks aromaatsusele peab molekul olema ka jäik.

Näiteks kvantsaagised fluoreenile ja bifenüülile on vastavalt 1,0 ja 0,2. Sellist käitumise erinevust võib seletada fluoreeni molekuli jäikusega, mida põhjustab sillana käituv metüleenrühm. Madal jäikus suurendab mittekiirgusliku ülemineku tõenäosust, kuna mittekiirguslik relaksatsioon põhineb võnkumistel. Mida vähem on molekulil painduvaid osi, seda keerulisem on tal mittekiirguslikult relakseeruda. Ka väga paljud metallikompleksid on jäigad, kuna metall orienteerib ligandid tugevalt enda ümber. Näiteks fluorestsentsi intensiivus vabal 8-hüdroksükinoliinil on palju väiksem kui tema jäigal metallikompleksil. Elektrodonoorsete rühmade rohkus ning elektronaktseptoorsete rühmade vähesus suurendavad fluorestsentsi tõenäosust.[6]

Happelise või aluselise kõrvalrühmaga aromaatse ühendi fluorestseerumisvõime on tavaliselt sõltuv pH-st. Nii emiteeruva kiirguse lainepikkus kui ka intensiivsus on tõenäoliselt erinevad ühendi ioniseeritud ja mitteioniseeritud vormi puhul.

Rakendused[muuda | redigeeri lähteteksti]

Valgustus[muuda | redigeeri lähteteksti]

Esimest korda näidati avalikkusele fluorestsentslampe 1939. aastal New Yorgis. Fluorestsentslamp on oma olemuselt gaaslahenduslamp. Klaastoru sees on osaline vaakum ja väike kogus elavhõbedat. Elektrilahendus paneb elavhõbeda aatomid emiteerima UV-kiirgust. Toru on ääristatud fosfooriga, mis neelab UV-kiirgust ja kiirgab nähtavat valgust. Fluorestsentslamp on energiasäästlikum kui hõõglamp. Samas võib ebaühtlane fluorestsentslambi spekter põhjustada mõnede värvide ebaharilikku väljanägemist võrreldes hõõglambi või päevavalguse käes nägemisega. Elavhõbeda gaasi kiirgusspektris domineerib lühilaineline UV-joon 254 nm juures, lisaks on veel olemas nähtava valguse jooned 436 nm (sinine), 546 nm (roheline) ja 579 nm (kollane) juures. Valget valgust emiteerivad dioodid (light-emitting diodes – LED) tulid kasutusse 1990. aastate keskel LED-lampidena. LED-lampides tabab pooljuhist kiirguv sinine valgus luminofoori, sealt edasi ühineb sinine valgus luminofoorilt emiteeruva rohelise ja punase fluorestsentsiga, tootes valget valgust.

Analüütiline keemia[muuda | redigeeri lähteteksti]

Paljud analüütilised protseduurid hõlmavad fluoromeetri kasutamist. Meetodi kõrge tundlikkuse tõttu on võimalik mõõta väga madalaid kontsentratsioone ja seda kasutatakse jälgede määramisel. Fluorestsentsi saab efektiivselt kasutada ka kromatograafias detektorina. Fluorestsentsi iseloomust tulenevalt on tegemist väga selektiivse detektoriga (nähakse ainult fluorestseeruvaid analüüte). Võrreldes vedelikukromatograafias kõige levinuma UV-Vis detektoriga on fluorestsentsdetektor oluliselt tundlikum

Jaguneva raku fluorestsents. DNA on sinine, valk nimega INCEP on roheline ja mikrotuubulid on punased. Iga fluorofoori pildistati eraldi vastavate lainepikkuste juures ja seejärel fotod ühendati.

(avastamispiir on ligikaudu tuhat korda madalam, ulatudes ppm-ide ja ppb-de suurusjärku). Planaarkromatograafias saab plaate visualiseerida, kui ühend või värviv reagent on fluorestseeriv. Fluorestsents on kõige efektiivsem, kui Boltzmanni jaotuse järgi on madalamatel energiatasemetel palju aatomeid. Sellisel juhul on ergastumise ja footonite kiirgamise tõenäosus suurem, mis teeb analüüsi tõhusamaks.

Biokeemia ja meditsiin[muuda | redigeeri lähteteksti]

Loodusteadustes kasutatakse fluorestsentsi mittedestruktiivse viisina bioloogiliste molekulide uurimisel. Kuna vähesed rakukomponendid on iseeneslikult fluorestseeruvad (autofluorestsents), siis saab neid jälgida kindlal sagedusel, kus puudub taustamüra ergastavast kiirgusest. Ka valku või mõnda muud ühendit saab märgistada välise fluorofooriga: fluorestsentsvärviga. Värvi kvantifitseerimist saab teha spektrofluoromeetriga ja seda rakendatakse näiteks järgnevatel juhtudel:

  • Fluorestsentsmikroskoopias, kus skaneeritakse kudesid, rakke või rakusiseseid struktuure. Antikeha märgistatakse fluorofooriga ja lastakse sel leida proovis oma sihtmärk: antigeen. Erinevate antikehade märgistamine erinevate fluorofooridega lasevad korraga visualiseerida mitu erinevat sihtmärki.
  • Automatiseeritud DNA järjestamises on igal neljast ahela lõpus olevast alusest oma spetsiaalne fluorestseeruv märgis. Kui märgistatud DNA molekul on eraldatud, ergastatakse märgis UV-kiirgusega ja molekuli lõpus asuvat alust saab kindlaks teha emiteeruva valguse lainepikkuse järgi.
Etiidiumbromiid
  • DNA detekteerimisel kasutatakse ka etiidiumbromiidi. Kui etiidiumbromiid on lahuses vabalt, fluorestseerib ta vähe. Ta fluorestseeruvad omadused suurenevad märgatavalt pärast seondumist DNA molekuliga. Seega on see ühend väga kasulik DNA fragmentide visualiseerimisel. Samas võib etiidiumbromiid olla kantserogeenne, ohutum alternatiiv oleks kasutada värvi SYBR Green.
  • Immunoloogias kinnitatakse antikehale fluorestseeruv rühm ja kohad, kuhu antikeha kinnitub, on fluorestsentsi tõttu näha ja isegi kvantifitseeritavad.
  • FRET (Försteri resonantsenergia ülekanne) on kasutusel valkude interaktsioonide uurimisel, nukleiinhapete järjestuse tuvastamisel ja biosensoritena. Fluorestsentsi eluaeg annab siin veel lisainformatsiooni juurde.

Vaata ka[muuda | redigeeri lähteteksti]

Viited[muuda | redigeeri lähteteksti]

  1. 1981. Tehnikaleksikon. Tallinn, Valgus. 656 lk
  2. 2,0 2,1 Principles Of Instrumental Analysis F.James Holler, Douglas A. Skoog & Stanley R. Crouch 2006
  3. A Brief History of Fluorescence and Phosphorescence before the Emergence of Quantum Theory Bernard Valeur and Mrio N. Berberan-Santos J. Chem. Educ., 2011, 88 (6), pp 731–738, doi 10.1021/ed100182h
  4. Structure and Formation of the Fluorescent Compound of Lignum nephriticum A. Ulises Acua, Francisco Amat-Guerri, Purificacin Morcillo, Marta Liras and Benjamn Rodrguez Org. Lett., 2009, 11 (14), pp 3020–3023, doi 10.1021/ol901022g
  5. Stokes, G. G. (1852). "On the Change of Refrangibility of Light". Philosophical Transactions of the Royal Society of London 142: 463–562. doi:10.1098/rstl.1852.0022. 
  6. Aine "Spektroskoopilised analüüsimeetodid" loengumaterjalid Tartu Ülikoolis