Kapillaarelektroforees

Kapillaarelektroforeesi süsteem skemaatiliselt

Laetud osakeste paigutumine kvartskapillaari sees puhvri lahuses. Näidatud on elektroosmootse voo suund anoodi ja katoodi vahel ning liikuv ja liikumatu kiht

Kapillaarelektroforees (lühend KE või CE – capillary electrophoresis) on analüütilises keemias kasutatav elektriliselt laetud (ioonsete) osakeste lahutamise meetod, mis töötati välja 1960. aastatel.

Modifitseeritud kapillaarelektroforeesi meetodid võimaldavad lahutada ka neutraalseid orgaanilisi ühendeid, biomolekule jm. See ületab kõrgsurve vedelikukromatograafia (HPLC) võimalusi, kui tegu on suurte molekulidega või kui saadava proovi kogus on väga väike.

Kirjeldus

Elektroforees on analüütide lahutamise meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Laengut kandva osakese liikumise kiirus on võrdeline elektrivälja tugevusega ja osakese ioonlaenguga ning pöördvõrdeline osakese raadiusega ja keskkonna viskoossusega. Elektromigratsioonil põhinevad olulised ainete lahutusmeetodid on geelelektroforees ja kapillaarelektroforees.

Kapillaarelektroforeesi korral viiakse elektroforeesi protsess läbi 25–100-mikromeetrise sisediameetriga kvarts-, klaas- või polümeerses kapillaaris, mis on täidetud töölahusega (elektrolüüdiga) ja millele rakendatakse kõrgepinge 10–30 kV. Proovi sisestamise järel hakkavad selle komponendid elektriväljas elektroosmootse voo mõjul liikuma erineva kiirusega vastavalt osakeste laengule ja mõõtmetele, mistõttu toimub nende lahutamine tsoonideks. Kapillaari lõpuosas olevas detekteerimispunktis (levinumad on UV-, elektrijuhtivus- ja fluorestsentsdetektorid) registreeritakse komponentide kontsentratsioonile vastavad signaalid (piigid) ajalises järjestuses, saadakse elektroferogramm.

Kapillaarelektroforeesi seade (lihtsustatud skeem on joonisel) koosneb kõrgepinge allikast, mis on ühendatud elektrolüüdi lahust (puhverlahust) sisaldavate anumatega, millest ühes on anood ja teises katood. Neid anumaid ühendab sama elektrolüüdilahusega täidetud kapillaar, selle katoodipoolne osa läbib tajuri, mille signaal saadetakse registreerimisseadmesse. Analüüsitava proovi kapillaari sisestamiseks ühendatakse selle anoodipoolne ots ja pingeallikas lühiajaliselt proovi sisaldavasse anumasse. Kõrgepinge toimel liiguvad kapillaaris molekulid ja ioonid katoodi poole, ehkki erinevate kiirustega. Kapillaari efektiivne pikkus, kus toimub analüütide lahutamine, on anoodist kuni detektorini.

See on osutunud efektiivseks meetodiks orgaaniliste biomakromolekulide, näiteks nukleiinhapped, peptiidid, proteiinid, süsivesikud, lipiidid jm lahutamisel.

Meetodi eelised

Võrreldes mitmete teiste instrumentaalanalüüsi meetoditega, on kapillaarelektroforeesil märkimisväärseid eeliseid:

• lihtne protseduur,
• väga väikesed proovi kogused (nanoliitrites),
• analüüside kiirus,
• hea lahutusvõime,
• meetod on kvantitatiivne,
• meetodi eri variatsioonid on rakendatavad alates väikestest ioonidest kuni suurte biomolekulide ja isegi rakkudeni,
• enamasti ei ole vajalik proovi töötlemine,
• ühe analüüsi käigus on võimalik lahutada katioone, anioone ja neutraalseid komponente.
• Kapillaarelektroforeesi proovisisestuse protseduurid ja tulemuste töötlus on kergesti arvutijuhtimisega automatiseeritavad. Kõik see annab suurepärased võimalused rakendada meetodit protsesside seireks reaalajas.

Lisaks eeltoodule saab kapillaarelektroforeesi ühendada ja kombineerida erinevate a) proovi sisestusseadmetega ja b) detekteerimissüsteemidega ning c) muude instrumentaalanalüüsi meetoditega.

Kapillaarelektroforeesi korral on tihti probleemiks asjaolu, et ainete liikumine kapillaaris elektrivälja toimel sõltub mitmest tegurist, sh ka proovi koostisest (maatriksist). Seetõttu võib ainete identifitseerimine olla komplitseeritud.

Meetodi modifikatsioone

Kapillaari sisu modifitseerimine loob võimalusi meetodi kasutusala oluliseks avardamiseks. Kasutatavamad kapillaarelektroforeesi variatsioonid (sulgudes on toodud inglise keelest tulenevad ja laialdaselt kasutatavad lühendid), mis erinevad kas lahutusmehhanismi või selektiivsuse poolest, on järgmised:

• klassikaline kapillaarne tsoonelektroforees (CE või CZE): kapillaaris on puhvri vesilahus – võimaldab lahutada ioone ja laetud molekule;
• kapillaarelektroforeesi frontaalanalüüs (CE-FA): puhvriga täidetud kapillaari sisestatakse suhteliselt suur kogus proovi – rohkem, kui on lahutamiseks vaja. Kasutatakse madala molekulmassiga ühendite (bioaktiivsete ühendite) ja valkude vaheliste interaktsioonide uurimisel;
• elektrokineetiline kromatograafia (EKC): siin kombineeruvad elektroosmoosi, elektroforeesi ja kromatograafia nähtused; puhvrile lisatakse ekstra-komponent, mis interakteerub (toimib) analüütidega;
• mitsellaarne elektrokineetiline kromatograafia (MEKC): kapillaaris on puhvri vesilahus, millele on lisatud pindaktiivset ainet, mis moodustab agregaadid (mitsellid) – võimaldab lahutada ka neutraalseid orgaanilisi ühendeid;
• kapillaarne geelelektroforees (CGE): kapillaari on tekitatud geel, milles väikesed molekulid liiguvad kiiremini kui suured – võimaldab lahutada proteiine, nukleiinhappeid jm;
• kapillaarne isoelektriline fokuseerimine (CIEF): kapillaaris on geel, milles tekitatakse pH gradient – võimaldab lahutada valkusid;
• afiinsuskapillaarelektroforees (ACE): kapillaaris toimib interaktsioon lahutatavate ainete ja spetsiaalselt lisatud ühendite vahel (näit ensüüm–substraat (keemia), ravim–proteiin, antigeen–antikeha interaktsioonid). Kasutatakse bioloogiliselt aktiivsete ainete analüüsimiseks;
• kapillaarne elektrokromatograafia (CEC) ühendab kapillaarelektroforeesi ja vedelikkromatograafia iseloomu: kapillaaris on kromatograafiline täidis ja eluent-elektrolüüt ning ained liiguvad elektriväljas – võimaldab lahutada väga erinevaid ühendeid;
• mittevesikeskkonnaline kapillaarelektroforees (NACE): kapillaaris on orgaaniline solvent (metanool, atsetonitriil), mis võib olla ioonse vedeliku lisandiga – võimaldab lahutada vees mittelahustuvaid orgaanilisi ühendeid;
• elektroforeetiliselt vahendatud mikroanalüüs (EMMA). Siin kujutab kapillaar endast mikroreaktorit, milles toimub reaktsiooniprotsess ja sellele järgnev reaktsioonisegu komponentide lahutamine. Sel juhul on kapillaari eelnevalt sisestatud substraadi ja reagendi tsoonid. Võimaldab läbi viia aktiivsusteste ja määrata kineetilisi konstante.

Kapillaarelektroforeesi uurimine Eestis

Selle uurimissuuna juured ulatuvad omaaegse TA Keemia Instituudi analüütilise keemia osakonda, kus hakati välja töötama arvutite juhitavaid efektiivseid instrumentaalanalüüsi meetodeid. 1991. aastal alustati Mihkel Kaljuranna initsiatiivil kapillaarelektroforeesi (CE) kui uue perspektiivse lahutusmeetodi arendamist. Esimene seade oli omaehitatud kasutades värvitelerit, kõrgepinge allikat, laenatud kapillaarijupikest ja kellegi äravisatud fluorestsentsdetektorit. Edasi tuli vastavat aparatuuri täiustada ja leida kasutusalasid. Ehitati veel mitu arvutiga ühendatud seadet.

Seoses TA Keemia Instituudi tegevuse lõpetamisega ja professor Mihkel Kaljuranna uurimisgrupi üleviimisega kandus 2002. aastal kapillaarelektroforeesiga seotud teadustöö TTÜ keemiainstituuti.

Välja on töötatud kapillaarelektroforeesi automatiseerimise ja arvutiseerimise süsteeme, spetsiifilisi proovi sisestamise süsteeme, sidussüsteeme teiste meetoditega kombineerimiseks (LC-CE, CE-MS) ning portatiivseid kapillaarelektroforeesi aparaate. Uuritud on kapillaarelektroforeesi rakendusi taimsete antioksüdantide (biofenoolide) aktiivsuse määramiseks, valkude ja bioaktiivsete ühendite vaheliste vastasmõjude uurimiseks ning mitmesuguste protsesside seireks, näiteks fenoolide degradatsioon, mikroorganismide kasv (orgaaniliste hapete määramise kaudu), ATP/ADP konversioon jm. Kapillaari seinte või kasutatavate töölahuste modifitseerimine ioonsete vedelikega lubas laiendada meetodi kasutusala, näiteks lahutada neutraalseid hüdrofoobseid ühendeid. Ioonsete vedelike kasutamine võimaldas välja arendada elektroforeesi ja massispektromeetria meetodite otseühendamise liidessüsteemi. Arendatud on uudseid lahendusi makromolekulide lahutamiseks kasutades polümeerset kapillaari ja kontaktita juhtivusdetektorit.

2007. aastal määrati EV teaduspreemia tööde tsükli "Elektromigratsioonilised meetodid bioprotsesside analüüsis" eest Mihkel Kaljurannale (kollektiivi juht), Mihkel Koelile ja Merike Vaherile. Esitatud taotlus

Vaata ka

• Elektroforees
• Elektromigratsioon
• Elektroosmootne voog (EOF)
• Lahutusmeetodid
• Instrumentaalanalüüs

Valik publikatsioone

1. Kulp, M; Kaljurand, M; Kaambre, T; Sikk, P; Saks, V, In situ monitoring of kinetics of metabolic conversion of ATP to ADP catalyzed by MgATPases of muscle Gastrocnemius skinned fibers using micellar electrokinetic chromatography. Electrophoresis, 25,17 (2004) 2996–3002.
2. Kulp, M; Vaher, M; Kaljurand, M, Miniaturization of sampling for chemical reaction monitoring by capillary electrophoresis, J.Chromatogr. A, 1100, 1 (2005) 126–129.
3. Vaher, M; Ehala, S; Kaljurand, M, On-column capillary electrophoretic monitoring of rapid reaction kinetics for determination of the antioxidative potential of various bioactive phenols. Electrophoresis, 26, 4 (2005) 990–1000.
4. Vaher, M; Viirlaid, S; Ehrlich, K; Mahlapuu, R; Jarvet, J; Soomets, U; Kaljurand, M, Characterization of the antioxidative activity of novel nontoxic neuropeptides by using capillary electrophoresis. Electrophoresis, 27, 13 (2006) 2582–2589.
5. Borissova, M.; Vaher, M.; Koel, M. (2007). Capillary zone electrophoresis on chemically bonded imidazolium based salts. Journal of Chromatography A, 1160(1–2), 320–325.
6. Borissova, M.; Gorbatsova, J.; Ebber, A.; Kaljurand, M.; Koel, M.; Vaher, M. (2007). Nonaqueous CE using contactless conductivity detection and ionic liquids as BGEs in ACN. Electrophoresis, 28(20), 3600 – 3605.
7. Kuban, P.; Seiman, A.; Makarõtševa, N.; Vaher, M.; Kaljurand, M. (2011). In situ determination of Sarin, Soman and VX nerve agents in various matrices by portable capillary electropherograph with contactless conductivity detection. Journal of Chromatography A, 1218(18), 2618–2625.
8. Helmja, K.; Vaher, M.; Kaljurand, M. (2011). Evaluation of the free radical scavenging capability of wheat extracts by capillary electrophoresis and multivariate curve resolution. Electrophoresis, 32(9), 1094 – 1100.
9. Seiman, A.; Vaher, M.; Kaljurand, M. (2011). Thermal marks as a signal processing aid for portable capillary electropherograph. Electrophoresis, 32(9), 1006 – 1014.