Maatriksi assisteeritud laserdesorptsioon-ionisatsioon

Allikas: Vikipeedia
MALDI-TOF massispektromeeter

Maatriksi assisteeritud laserdesorptsioon-ionisatsioon (MALDI) on pehme ionisatsioonitehnika, mida kasutatakse massispektromeetrias. MALDI avardas makromolekulide, näiteks DNA, valkude, polümeeride) massispektromeetrilisi analüüsivõimalusi. MALDI võimaldab saada teiste laiemalt levinud pehmete ionisatsioonitehnikatega võrreldes rohkem ühelaengulisi fragmenteerimata ioone.[1]

MALDI puhul neelab kiirgust maatriks ning energiaülekanne analüüdile toimub peamiselt soojusülekande kaudu, samas pole ioonide tekkemehhanism päris selge, kuid selle kohta on esitatud mitu teooriat.[2]

Ajalugu[muuda | muuda lähteteksti]

Kõrgmolekulaarsete ühendite uurimine oli enne MALDI välja töötamist raskendatud. Elektronionisatsiooni toimel nad fragmenteeruvad ning elektropihustusionisatsioon tekitab mitmelaengulisi ioone, mis mõningate analüüside puhul ei ole soovitud. Varem kasutati kõrge molekulmassiga ühendite spektromeetriliseks uurimiseks kiirete aatomitega pommitamist (fast atom bombardment, FAB) või keemilist derivatiseerimist. Need meetodid on ajamahukad, vähem efektiivsed ning kiirete aatomitega pommitamine on lisaks ka suuremahuliseks kasutamiseks liiga kallis.[3]

MALDI töötasid välja Franz Hillenkamp ja Michael Karas, kes oma esimese töö MALDI alal avaldasid aastal 1985. Nad leidsid, et alaniini massispektri saamiseks trüptofaaniga segus vajati oluliselt väiksemat laseri võimsust kui puhta alaniini korral. Antud maatriksi abil ioniseeriti peptiide massiga kuni 2843 Da (melittiin).[4][5] 1987. aastal avaldas Koichi Tanaka mitmete valkude MALDI-spektrid, näiteks karboksüpeptidaas-A (34 472 Da), kümotrüpsinogeen (25 717 Da) ja tsütokroom c (12 384 Da). Ta kasutas maatriksina koobalti nanoosakesi glütseroolis ja lämmastiklaserit (337 nm).[6]

1988. aastal avaldasid Karas ja Hillenkamp nelja valgu MALDI-spektrid (suurim neist oli veise albumiin, 67 kDa), nad kasutasid maatriksina nikotiinhapet ja Nd:YAG-laserit (266 nm).[7]

Tanaka avaldas samal aastal MALDI-spektrid valkudest molekulmassiga kuni 100 kDa.[6]

2002. aastal anti Koichi Tanakale (nelja vahel jagatud) Nobeli keemiaauhind tema panuse eest valkude massispektromeetriliste uurimismeetodite arendusse.[8]

Aparatuur[muuda | muuda lähteteksti]

MALDI kui ionisatsioonitehnika on kombineeritav mitmesuguste massispektromeetria instrumentidega. Esimesena tulid turule MALDI seadmed lennuaja massispektromeetritega (TOF-MS), kus laser oli paigutatud aksiaalselt. Hiljem leiti, et ortogonaalne paigutus vähendab proovi ebaühtluse mõju ning parandab tulemuste täpsust. Tänapäeval on MALDI instrumentide valik lai ning neid on võimalik kasutada koos sisuliselt kõigi erinevate massispektromeetrialiikide instrumentidega. Peptiidide massianalüüsiks kasutatakse peamiselt lennuaja- ja kvadrupoolmassispektromeetreid, suuremat täpsust ja massilahutust vajavate rakenduste, näiteks gaasifaasiliste aluselisuste ja happelisuste) mõõtmiseks on kasutusel MALDI/FT-ICR-instrumendid.[3]

Laser[muuda | muuda lähteteksti]

UV-MALDI puhul kasutatakse enamasti lämmastiklaserit (337 nm) ja Nd:YAG-laserit (355 nm ja 266 nm). Kuigi algselt kasutati neljakordistatud sagedusega Nd:YAG-lasereid (266 nm), siis enamasti on uurimistöödes kasutatud lämmastiklasereid, sest need on odavamad, efektiivsemad ja väiksemad. Suure töömahuga aparatuuride puhul sobib aga Nd:YAG-laser paremini. Nd:YAG-laser võimaldab üle 1000, lämmastiklaser vaid kuni 50 impulssi sekundis. Nd:YAG-laseri eluiga on samuti oluliselt pikem, ulatudes miljarditesse impulssidesse, samal ajal kui lämmastiklaserite eluiga jääb vahemikku 20–60 miljonit lasku.[9]

IR-MALDI ei ole niivõrd populaarne, kuid sellel on omad eelised UV-MALDI ees. Infrapunakiirgus on madalama energiaga, seetõttu võimaldab pehmemat ionisatsiooni ja väiksemat fotokeemiliste reaktsioonide saaduste hulka. IR-MALDI tundlikkus on väiksem, ta annab rohkem mitmelaengulisi ioone ja eemaldab lasu kohta rohkem proovi. UV-laseri kiirguse saab muundada infrapunakiirguseks, kasutades optilist parameetrilist ostsillaatorit. Kasutatakse ka mitut liiki infrapunalasereid, näiteks Er:YAG-, TEA-CO2-laser jt.[1]

Proovi ettevalmistus[muuda | muuda lähteteksti]

Maatriksiks sobivatel ainetel on järgmised omadused:

Sobiva maatriksi valik tehakse tihti katse-eksituse meetodil või tuginedes varasematele andmetele.

Peamiselt kasutatakse happelisi maatrikseid, nagu näiteks 2,5-dihüdroksübensoehapet (DHB), α-tsüano-4-hüdroksükaneelhapet ja sinephapet (3,5-dimetoksü-4-hüdroksokaneelhape). Kasutust leiavad ka mõningad pikoliinhappe ning teised kaneelhappe derivaadid. Maatriksile lisatakse sobiv kogus uuritavat ainet ning saadud segu lahustatakse. Tavaliselt kasutatakse lahustina vee ja mõne orgaanilise solvendi, näiteks atsetonitriil, segu.[10]

Maatriksi ja analüüdi lahus kantakse MALDI-plaadile (spetsiaalselt disainitud metallplaat) laikudena. MALDI-analüüsid toimuvad kõrgvaakumis. Lahusega kaetud plaadilt solvendid aurustuvad, jättes plaadile uuritava aine ja maatriksi kristallilise segu. Eesmärgiks on saada võimalikult paks kiht peeneid kristalle, maatriks ja uuritav aine peavad olema jaotunud võimalikult ühtlaselt.

Korduvus ja kalibratsioon[muuda | muuda lähteteksti]

Analüüdi-maatriksi vahekord võib varieeruda laigu ulatuses olulisel määral, sest nende lahustuvused solventides on erinevad. Laigu kuivamine toimub äärtelt keskele. Seega komponendid, mis hakkavad solvendi aurustumisel varem kristalliseeruma, jäävad rohkem laigu äärtele ning vähem keskele. Nii võivad laseriimpulsside tekitatud ioonpaketid oluliselt üksteisest erineda, põhjustades ka erinevaid tulemusi. Sisestandardiga kalibreerimine on raskendatud, sest kergemini ioniseeruvad molekulid kipuvad tagasi tõrjuma raskemini ioniseeruvate ainete ionisatsiooni.[11]

Kuna MALDI peamised rakendused on seotud suure molekulmassiga molekulide analüüsidega, on vaja ka vastavate molekulmassidega kalibrante, mis peaksid olema võimalikult robustsed ja kasutajasõbralikud. Tavalised kalibrandid on valmistatud erinevatest valkudest ja peptiididest, nende puhastamine on aga kallis ning tihti on nende stabiilsus tavatingimustel kehv. Seetõttu on välja töötatud mitmed kalibreerimiskomplekte, mis sisaldavad diskreetse massiga sünteetilisi molekule (näiteks SpheriCal).[12]

Rakendused[muuda | muuda lähteteksti]

Biokeemia[muuda | muuda lähteteksti]

MALDI/TOF-massispektromeetrite üks olulisemaid rakendusi on peptiidide sõrmejäljed molekulmassi alusel (peptide mass fingerprinting, PMF). Erinevate aminohappejärjestusega peptiidide massid ("sõrmejäljed") on andmebaasides täpselt määratud. Uuritavate peptiidide analüüsil saadakse spekter, mille massi täpsel määramisel on võimalik vastava andmebaasi olemasolul omistada peptiidile kindel aminohappeline koostis. Sel moel on võimalik tuvastada üle 90% valkudest. MALDI/TOF-TOF abil on võimalik määrata peptiidi aminohappelist järjestust. Selleks uuritakse eellasioonide lagunemist vahetult pärast ioonallikast lahkumist (post-source decay, PSD). Vajadusel kasutatakse fragmentatsiooni esile kutsumiseks ioonide kiirendamist elektriväljas. Ioonide põrkumisel inertgaasi molekulidega toimub sidemete lõhkumine ja ioonide fragmentatsioon (collision-induced dissociation, CID).[13]

Polümeeride keemia[muuda | muuda lähteteksti]

MALDI/TOF-spektromeetri abil on võimalik kiirelt ja usaldusväärselt analüüsida madala polüdisperssuse indeksiga (kuni 1,1) polümeeride mass- ning arvkeskmistatud molekulmasse, polüdisperssust ja määrata polümeermolekulide otsmisi rühmi. Kõrgema polüdisperssuse indeksiga polümeeride jaoks kasutatakse lisaks suuruseralduskromatograafiat (size-exclusion chromatography, SEC). Nii ioniseeritakse ühel ajahetkel sarnase molekulmassiga molekulid ning tagatakse ka SEC-kolonni kalibratsioon massi järgi.[14]

Mikrobioloogia[muuda | muuda lähteteksti]

Pikka aega tuvastati baktereid fenotüüpide alusel või geenijärjestuste määramise abil. Aastal 1996 leiti, et MALDI/TOF-süsteemi abil on võimalik bakterirakkudest saada spektreid, mida võib käsitleda kui bakteriliigi sõrmejälge. Analüüsi läbiviimiseks vajaliku ettevalmistuse tagavad üldjuhul tavalised MALDI-proovi ettevalmistuse protseduurid. Sarnaselt võib spektreid saada ka seentest ja viirustest. Bakteriliikide spektritele või individuaalsete biomarkerite massidele otsitakse vasteid vastavatest andmebaasidest.[15]

MALDI/TOF-spektritel on veel muid kitsamaid rakendusi meditsiinis ja teistes valdkondades. MALDI/FT-ICR leiab kasutust näiteks tasakaaluliste gaasifaasiliste aluselisuste ja happelisuste uurimisel.[16][17]

Viited[muuda | muuda lähteteksti]

  1. ↑ 1,0 1,1 1,2 Shufang Niu; Wenzhu Zhang; Brian T. Chait (jaanuar 1998). "Direct comparison of infrared and ultraviolet wavelength matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins". 9 (1). Journal of the American Society for Mass Spectrometry.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) DOI:10.1016/S1044-0305(97)00236-5
  2. ↑ R. Zenobi; Knochenmuss, R. (1998). "Ion formation in MALDI mass spectrometry". 17 (5): 337–366. Mass Spectrometry Reviews.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  3. ↑ 3,0 3,1 Aileen Constans (29. august 2005). "Maldi". The Scientist.
  4. ↑ Franz Hillenkamp; Michael Karas (2000). "Matrix-assisted laser desorption/ionisation, an experience" (PDF). 200 : 71–77. Journal of Mass Spectrometry.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  5. ↑ M. Karas; Bachmann, D.; Hillenkamp, F. (1985). "Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules". 57 (14) : 2935–2939. Analytical Chemistry.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) DOI:10.1021/ac00291a042
  6. ↑ 6,0 6,1 K. Tanaka; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T.; Matsuo, T. (1988). "Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization Time-of flight Mass Spectrometry". 2 (20): 151–153. Rapid Communications in Mass Spectrometry.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) DOI:10.1002/rcm.1290020802
  7. ↑ M. Karas; Hillenkamp, F. (1988). "Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons". 60 (20): 2299–2301. Analytical Chemistry.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) DOI:doi:10.1021/ac00171a028
  8. ↑ K Markides; Gräslund, A (2002). "Advanced information on the Nobel Prize in Chemistry 2002" (PDF). 11–13. The Royal Swedish Academy of Sciences.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  9. ↑ A. Holle; A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf (juuni 2006). "Optimizing UV laser focus profiles for improved MALDI performance". 41 (6): 705–716. Journal of Mass Spectrometry.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) DOI:10.1002/jms.1041
  10. ↑ Walter, A.Korfmacher (2009). "Using Mass Spectrometry for Drug Metabolism Studies". lk. 342. CRC Press. DOI:10.1016/S1044-0305(97)00236-5
  11. ↑ Martin Kempka (2005). "Improved Mass Accuracy in MALDI-TOF-MS Analysis" (PDF). Royal Institute of Technology.
  12. ↑ S. M. Grayson; Myers, B. K.; Bengtsson, J.; Malkoch, M. (2014). "Advantages of Monodisperse and Chemically Robust "SpheriCal" Polyester Dendrimers as a "Universal" MS Calibrant". 25: 303–309. J. Am. Soc. Mass Spectrom.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  13. ↑ Andrej Shevchenko; Ole N. Jensen, Alexandre V. Podtelejnikov, Francis Sagliocco, Matthias Wilm, Ole Vorm, Peter Mortensen, Anna Shevchenko, Helian Boucherie, Matthias Mann (jaanuar 1996). "Linking genome and proteome by mass spectrometry: Large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels". The National Academy of Sciences of the USA.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  14. ↑ Michel W. F. Nielen (1998). "Polymer Analysis by Micro-Scale Size-Exclusion Chromatography/MALDI Time-of-Flight Mass Spectrometry with a Robotic Interface". 70 (8): 1563–1568. Anal. Chem. DOI:10.1021/ac9712409
  15. ↑ Antony Guy Prod'hom, Gilbert Greub (2012). "Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology". 36 (2): 380–407. FEMS Microbiology Reviews. DOI:http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6976.2011.00298
  16. ↑ K. Sim; Shaw, A. G.; Randell, P.; Cox, M. J.; McClure, Z. E.; Li, M. S.; Haddad, M.; Langford, P. R.; Cookson, W. O.; Moffatt, M. F.; Kroll, J. S. (2014). "Linking genome and proteome by mass spectrometry: Large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels". Dysbiosis anticipating necrotizing enterocolitis in very premature infants.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  17. ↑ N. Zhong; Cui, Y.; Zhou, X.; Li, T.; Han, J. (2015). "Identification of prohibitin 1 as a potential prognostic biomarker in human pancreatic carcinoma using modified aqueous two-phase partition system combined with 2D-MALDI-TOF-TOF-MS/MS". 36 (2). Tumour Biol.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
Pärit leheküljelt "https://et.wikipedia.org/w/index.php?title=Maatriksi_assisteeritud_laserdesorptsioon-ionisatsioon&oldid=6054644"