Kasutaja:Kj19/Dna kloneerimine

Allikas: Vikipeedia

DNA kloonimine on eksperimentaalsete meetodite kogum molekulaarbioloogias, mida kasutatakse huvipakkuvate rekombinantsete DNA molekulide saamiseks ja nende replitseerimiseks peremeesorganismis.[1] Sõna "kloonimine" kasutamine viitab asjaolule, et algset DNA molekuli replitseeritakse ühes elusrakus, et saada suur hulk tütarrakke, mis sisaldavad identseid DNA molekule. Molekulaarse kloonimise puhul kasutatakse tavaliselt DNA järjestusi, mis on pärit kahest erinevast organismist: üks, mis sisaldab huvipakkuvat geeni ning mida tahetakse kloonida, ja teine, mis replitseerib rekombinantset DNA-d. (tavaliselt kasutatakse bakterite plasmiide). Molekulaarse kloonimise meetodid on võtmeks paljudele kaasaegsetele meditsiini ja bioloogia valdkondadele.[2]

Tavalises molekulaarse kloonimise eksperimendis hangitakse DNA, mida kloonima hakatakse, huvipakkuvast organismist. Seejärel proovi töödeldakse erinevate ensüümidega (restriktaasidega), et saada väiksemaid DNA fragmente. Järgnevalt kombineeritakse need fragmendid vektor-DNA-ga, et saada rekombinantseid DNA molekule (ligeerimine). Seejärel viiakse rekombinantsed molekulid peremeesorganismi, milles neid paljundatakse koos organismi DNA-ga ja saadakse suur hulk järglasi, mis sisaldavad rekombinantset DNA-d. Seda protsessi nimetatakse transformatsiooniks. Peremeesorganismina kasutatakse tavaliselt kergesti kultiveeritavat ja hästi kasvavat bakteritüve, mis pole liiga patogeenne, näiteks E.coli laboritüve. Kuna need organismid sisaldavad võõr-DNA-d, siis neid nimetatakse transgeenseteks või geenmuundatud organismideks.[3] Siinkohal kasutatakse ära kompetentsete bakterite võimet sisse võtta võõr-DNA-d ja seda replitseerida. Seda üksikut bakterit saab ekspodentsiaalselt paljundada nii, et tulemuseks on suur järglaskond baktereid, kes kõik sisaldavad huvipakkuvat rekombinantse DNA molekuli koopiat. Tihtipeale öeldakse nii bakterite järglaskonna kui ka rekombinantse DNA molekulide kohta kloonid. Tegelikult viitab "rekombinante DNA" DNA molekulidele ja "molekulaarne kloonimine" eksperimentaalsetele meetoditele rekombinantse DNA kokkupanekuks.

Ajalugu[muuda | muuda lähteteksti]

Enne 1970-ndaid mõjutas arusaamu geneetikast ja molekulaarbioloogiast tugevasti asjaolu, et ei oldud võimelised isoleerima ja eraldama üksikuid geene komplekssetest organismidest ning seetõttu ei suudetud uurida nende funktsioone. Geneetika ja molekulaarbioloogia mõistmine muutus täielikult koos molekulaarsete kloonimismehhanismide tekkega. Mikrobioloogid, kes üritasid mõista molekulaarseid mehhanisme, mis peituvad bakterite võime taga piirata bakteriofaagide kasvu, isoleerisid restriktaasi. Restriktaas on ensüüm, mis suudab lõigata DNA ahelat ainult spetsiifiliste järjestuste, restriktsioonisaitide, olemasolul.[4] Näidati, et restriktaasid lõikavad kromosomaalset DNA-d kindlates saitides ja hiljem on võimalik väljalõigatud DNA fragmendid fraktsioneerimise abil puhastada. Kasutades teist ensüümi, DNA-ligaasi, saab liita erinevaid restriktaaside lõigatud fragmente kokku uuteks, teistsuguse järjestusega DNA lõikudeks. Neid uusi molekule nimetatakse rekombinantseks DNA-ks. Kui liita huvipakkuva DNA lõik vektor-DNA-ga, näiteks bakteriofaagi või plasmiidiga, mis loomulikul teel replitseerub bakteris, saame bakterikultuuris toota suurel hulgal puhtaid rekombinantse DNA molekule ning need sealt hiljem välja puhastada. Esimene rekombinante DNA molekul konstrueeriti ja selle omadusi uuriti 1972. aastal.[5][6]

Ülevaade[muuda | muuda lähteteksti]

Molekulaarne kloonimine kasutab ära fakti, et DNA on oma põhistruktuurilt samasugune kõigis elavates organismides. Kui võtta ükskõik milline DNA lõik ükskõik millisest organismist ja sisestada see DNA lõiku (vektorisse), mis sisaldab replikatsiooniks vajalikke järjestusi ning sisestada rekombinantne DNA organismi, millest pärinevad replikatsiooni initsieerimise järjestused, siis paljuneb võõr-DNA koos peremeesraku DNA-ga transgeenses bakteris.

DNA kloonimise etapid[muuda | muuda lähteteksti]

Tavalises kloonimise katses koosneb iga DNA fragmendi kloonimine seitsmest etapist

  1. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik
  2. Vektor-DNA ettevalmistamine
  3. Kloonitava DNA ettevalmistamine
  4. Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil
  5. Rekombinantse DNA sisestamine peremeesorganismi
  6. Rekombinantide selekteerimine
  7. Rekombinantide analüüsimine (screening)

Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik[muuda | muuda lähteteksti]

Kuigi praeguseks kasutatakse väga mitmeid erinevaid peremeesorganisme ja vektoreid, siis suurem osa molekulaarse kloonimise eksperimentidest viiakse läbi E.coli laboritüvede ja plasmiidsete kloonimisvektorite abil. E.coli ja plasmiidsed vektorid on populaarsed, kuna need on mitmekülgsed, kergesti kättesaadavad ja pakuvad rekombinantsete organismide kiiret kasvu minimaalse varustuse olemasoluga.[3] Kui kloonitav DNA on väga suur (sada tuhat kuni mõni miljon aluspaari), siis kasutatakse vektorina tehislikku bakteri kromosoomi[7] või tehislikku pärmi kromosoomi.

Ükskõik milliseid kombinatsioone peremeesorganismidest või vektoritest kasutatakse, sisaldab vektor peaaegu alati nelja äärmiselt tähtsat DNA segmenti, mis vastutavad ta funktsioneerimise ja eksperimentaalse kasulikkuse eest.

  1. replikatsiooni origin, mis on vajalik vektori paljunemiseks (replitseerumiseks) peremeesorganismis.
  2. üks või mitu unikaalset restriktsioonisaiti, mis on restriktaasidele äratuntavad.
  3. selektiivne marker (Antibiootikumresistentsuse geen), mis võimaldab ellu jääda rakkudel, millesse on sisenenud rekombinante DNA vektor.
  4. Geen, mis võimaldab selekteerida (screenida) rakud, mis sisaldavad tühja vektorit või rekombinantset DNA-d (vektor+ kloonitav geen).[3]

Vektor-DNA ettevalmistamine[muuda | muuda lähteteksti]

Kloonimisvektorit töödeldakse restriktaasidega, et lõigata DNA-d saidist, kuhu sisestatakse võõr-DNA. Restriktaas, millega lõigata, valitakse nii, et lõikuse tulemusena tekkivad "kleepuvad otsad" sobiksid sisestatava võõr-DNA "kleepuvate otstega". Tavaliselt saavutatakse vajalik tulemus, kui lõigatakse nii vektorit kui ka sisestatavat DNA-d samade restriktaasidega nt. EcoR1-ga. Enamik tänapäevastest vektoritest sisaldavad mitmeid erinevaid unikaalseid restriktsioonisaite. Samas on iga sait esindatud ühe korra, et vältida vektori ribadeks lõikamist. Tavaliselt asuvad restriktsioonisaidid mingi geeni sees (sagedasti β-galaktosidaasi geen), mille inaktivatsiooni alusel saab vahet teha rekombinantsetel ja mitterekombinantsetel organismidel hilisemates etappides. Selleks, et suurendada rekombinantide tekke sagedust, töödeldakse lõigatud vektorit aluseliste fosfataasidega, mis defosforüülivad vektori lahtised otsad. Defosforüülitud otstega vektor ei ole võimeline replitseeruma ja selle võime saab taastada ainult siis, kui vektorisse integreerub kloonitav DNA.[8]

Kloonitava DNA ettevalmistamine[muuda | muuda lähteteksti]

Genoomse DNA kloonimiseks tuleb esmalt eraldada kloonitav DNA huvipakkuvast organismist. Põhimõtteliselt sobib selleks ükskõik milline koeproov (isegi väljasurnud organismi oma[9]) senikaua, kuni DNA pole ulatuslikult degradeerunud. DNA puhastatakse lihtsate meetoditega, et eraldada kontamineerivad valgud (fenooliga ekstraheerimine, RNA (ribonukleaasidega töötlemine) ja muud väiksemad molekulid (kromatograafia). Puhastatud DNA molekul amplifitseeritakse, kasutades PCR reaktsiooni.

Puhastatud DNA molekule töödeldakse samade restriktaasidega, millega eelnevalt töödeldi vektor-DNA-d, et saada komplementaarsed otsad DNA-de liitumiseks. Vajadusel lisatakse kloonitava ahela otsa lühikesed kaheahelalised restriktsioonisaite sisaldavad DNA lõigud (linkerid), mis on vajalikud vektor-DNA-ga liitumisel.[3][8]

Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil[muuda | muuda lähteteksti]

Rekombinantse DNA sünteesimine on kloonimisprotsessi üks lihtsamaid etappe. Ettevalmistatud vektor-DNA ja kloonitav-DNA segatakse õigetes kontsentratsioonides kokku ja lisatakse DNA ligaas, mis kovalentselt liidab eri ahelate komplementaarsed otsad kokku. Seda liitumisreaktsiooni nimetatakse ligatsiooniks. Saadud ligeerunud DNA molekulid on nüüd valmis peremeesorganismi sisseviimiseks.

DNA ligaas tunneb ära ja liidab ainult lineaarseid DNA ahelaid. Selle tulemusena tekib suur hulk erinevalt kokku pandud DNA molekule. Selles segus leidub kindlasti ka huvipakkuvat rekombinantset DNA-d (vektor+ kloonitav DNA), aga ka palju teisi molekule (nt. iseendaga ligeerunud tühi vektor, iseendaga ligeerunud kloonitav DNA, tagurpidi vektorisse ligeerunud kloonitav DNA jne). Nendest vabanetakse hilisemates kloonimisetappides, kui DNA on juba peremeesorganismi sisse viidud.[3][8]

Rekombinantse DNA sisendamine peremeesorganismi[muuda | muuda lähteteksti]

In vitro (katseklaasis, mitte elus organismis) töödeldud DNA viiakse nüüd taas elus rakku ehk peremeesorganismi. Meetodeid DNA sisestamiseks rakkudesse on erinevaid ja selle etapi nimetus tuleneb tavaliselt sellest, millist meetodit kasutatakse. (nt. transformatsioon, transduktsioon, elektroporatsioon[3][8])

Kui mikroorganismid on võimelised ümbritsevast keskkonnast endasse võtma ja replitseerima võõr-DNA järjestusi, siis nimetatakse seda protsessi transformatsiooniks ja selliseid rakke kompetentseteks[10] rakkudeks. Vähesed bakteriliigid on looduslikult kompetentsed. Suuremat osa neist tuleb enne kemikaalidega töödelda ja kasvatada kindlal režiimil (õige toitainete segu jne). Kompetentsete rakkude saamiseks vajalikud protsessid varieeruvad liigiti ja rakutüübiti.

Elektroporatsioon kasutab kõrgepingelisi elektriimpulsse, et viia võõr-DNA läbi rakumembraani või ka rakuseina, kui see esineb.[11] Transduktsiooni puhul sisestatakse võõr-DNA viiruse partiklisse (bakteriofaagi), mille genoomist on eemaldatud patogeensust põhjustav geneetiline materjal ja mis on bakteritele ohutu, ning siis nakatatakse rakke nende partiklitega. Toimub viiruse infektsioon ja DNA vabastatakse rakku. Tavaliselt on transduktsioon ja elektroporatsioon kõige efektiivsemad mehhanismid DNA sisestamiseks peremeesorganismi.

Rekombinantide selekteerimine[muuda | muuda lähteteksti]

Olenemata millist meetodit kasutatakse, on võõr-DNA rakku sisenemine väikese efektiivsusega. Ainult väike osa rakkudest võtab võõr-DNA oma koosseisu. Teadlased on selle probleemi lahendanud markergeenidega. Rakud, mis ei ole sisestatud järjestust omaks võtnud, tapetakse selektiivselt.[3][8] Kui peremeesorganismina kasutatakse baktereid, siis markergeeniks on tavaliselt mõne antibiootikumresistentsuse geen. Tavaliseks antibiootikumiks on ampitsilliin. Transduktsiooni/transformatsiooni/elektroporatsiooni läbinud rakud külvatakse Petri tassidele, mis sisaldavad lisaks kasvamiseks vajalikele toitainetele ka ampitsilliini. Bakterid, mis ei ole endasse võtnud võõr-DNA-d, ei sisalda antibiootikumresistentsuse geeni ja surevad. Kolooniad, mis jäävad ellu, sisaldavad sisestatud DNA-d, sest vektoris sisaldub lisaks sisestatud järjestusele ka antibiootikumresistentsuse geen.

Rekombinantide analüüsimine (screening)[muuda | muuda lähteteksti]

Tänapäevaste vektorite puhul kasutatakse rekombinantide eristamiseks rakkudest, mis on endasse võtnud algse, ilma inserdita vektori, sini-valge testi. Nende vektorite puhul sisestatakse kloonitav DNA järjestuse vahele, mis kodeerib β-galaktosidaasi olulist osa. β-galaktosidaas on ensüüm, mille aktiivsus väljendub siniste kolooniate tekkega bakterikultuuris. (β-galaktosidaas on hüdrolaasi ensüüm, mis katalüüsib β-galaktoosi hüdrolüüsi monosahhariidideks). Rakkudel, mis on omaks võtnud rekombinantse DNA, on see geen rikutud ja β-galaktosidaasi aktiivsus on kadunud. Sellised rakud ei värvu siniseks ja kolooniad jäävad valget värvi. Järgnevalt on võimalik kergesti eristada ja põhjalikumalt uurida kolooniad, mis sisaldavad soovitud rekombinantset DNA-d kolooniatest, mis sisaldavad algset, tühja vektorit.

Järgnevalt koondatakse üksikute kloonide genoomid DNA raamatukogudesse. See on vajalik, et kontrollida, kas erinevatesse kloonidesse on ikka kindlasti sisenenud soovitud DNA konstrukt. Selleks kasutatakse mitmeid erinevaid meetodeid, näiteks nukleiinhapete hübridisatsiooni, PCR'i, restriktsiooni fragmentide analüüsi või DNA sekveneerimist[3][8]

Viited[muuda | muuda lähteteksti]

  1. ↑ Watson, James D. (2007). Recombinant DNA: genes and genomes: a short course. San Francisco: W.H. Freeman. ISBN 0-7167-2866-4.
  2. ↑ Cheryl L. Patten; Glick, Bernard R.; Pasternak, Jack (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Washington, D.C: ASM Press. ISBN 1-55581-498-0.{{cite book}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  3. ↑ 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 Brown, Terry (2006). Gene cloning and DNA analysis: an introduction. Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 1-4051 -1121-6. Viitamistõrge: Vigane <ref>-silt; nime "isbn1-4051-1121-6" on määratud mitu korda erineva sisuga.
  4. ↑ Nathans D, Smith HO (1975). "Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules". Annu. Rev. Biochem. 44: 273–93. DOI:10.1146/annurev.bi.44.070175.001421. PMID 166604.
  5. ↑ Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB (1973). "Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (11): 3240–4. DOI:10.1073/pnas.70.11.3240. PMC 427208. PMID 4594039. {{cite journal}}: eiran tundmatut parameetrit |month= (juhend)CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  6. ↑ Jackson DA, Symons RH, Berg P (1972). "Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69 (10): 2904–9. DOI:10.1073/pnas.69.10.2904. PMC 389671. PMID 4342968. {{cite journal}}: eiran tundmatut parameetrit |month= (juhend)CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  7. ↑ Shizuya H; Birren B; Kim UJ; et al. (1992). "Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (18): 8794–7. DOI:10.1073/pnas.89.18.8794. PMC 50007. PMID 1528894. {{cite journal}}: eiran tundmatut parameetrit |author-separator= (juhend); eiran tundmatut parameetrit |month= (juhend)
  8. ↑ 8,0 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN 0-87969-576-5.{{cite book}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  9. ↑ Higuchi R, Bowman B, Freiberger M, Ryder OA, Wilson AC (1984). "DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family". Nature. 312 (5991): 282–4. DOI:10.1038/312282a0. PMID 6504142.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  10. ↑ Lederberg J (1994). "The transformation of genetics by DNA: an anniversary celebration of Avery, MacLeod and McCarty (1944)". Genetics. 136 (2): 423–6. PMC 1205797. PMID 8150273. {{cite journal}}: eiran tundmatut parameetrit |month= (juhend)
  11. ↑ Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S (1989). "Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation". Mol. Gen. Genet. 216 (1): 175–7. PMID 2659971. {{cite journal}}: eiran tundmatut parameetrit |month= (juhend)CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
Pärit leheküljelt "https://et.wikipedia.org/w/index.php?title=Kasutaja:Kj19/Dna_kloneerimine&oldid=3431533"