Transformatsioon (geneetika)

Allikas: Vikipeedia

Molekulaarbioloogias mõistetakse transformatsiooni all raku geneetilist muutumist, mis johtub vaba, valkude poolt sidumata eksogeense DNA sattumisest väliskeskkonnast läbi rakumembraani rakku, kus see raku enda geneetilise materjaliga liidetakse ning võõrgeeni ekspresseeritakse. Transformatsiooni tuleb ette nii mõnede bakteriliikide puhul looduses kui ka sihipärase tegutsemise tulemusena laboris. Transformatsioon on üks kolmest protsessist, mille käigus on võimalik võõr-DNA-d bakterirakku viia. Teisteks võimalusteks on konjugatsioon, mis ilmneb kahe bakteri otsesel kokkupuutel, ja transduktsioon, kus eksogeenne materjal viiakse bakterirakku bakteriofaagi abil. Baktereid, kes on võimelised transformeeruma, nimetatakse kompetentideks. Ka teisi rakke peale bakterite on võimalik transformeerida, näiteks taime- ja loomarakke, kuid eelistatum mõiste kirjeldamaks võõr-DNA viimist eukarüootsesse rakku on transfektisoon. Loomarakkude puhul välditakse antud protsessi puhul transformatsiooni mõiste kasutamist, sest "malignant transformation" ehk pahaloomuline transformatsioon tähendab ühtlasi ka normaalsete rakkude muutumist pahaloomulisteks kasvajarakkudeks, mil pole midagi pistmist rakuvälise geneetilise materjali sattumisega rakku.[1]

Ajalugu[muuda | redigeeri lähteteksti]

Esmakordselt demonstreeris transformatsiooni toimumist aastal 1928 briti bakterioloog Frederick Griffith, kes tegeles kahe Streptococcus pneumoniae tüve uurimisega. Kui Griffith süstis hiiri ohutu tüve (II-R) bakterite või kuumusega tapetud haigust tekitava tüve (III-S) bakteritega, jäid hiired ellu, kuid nende kahe kombinatsioon osutus hiirtele surmavaks. Surnud hiirte verest õnnestus tal isoleerida mõlema tüve elusaid rakke ning järeldas sellest, et mingi seaduspära järgi on võimalik ühe bakteritüve muundumine teiseks. Tema mõtet arendasid edasi Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty, kes tõestasid aastal 1944, et tegu on geneetilise materjali ülekandega. Kasutades samu tüvesid, isoleerisid nad virulentse tüve DNA ja näitasid, et selle viimisest II-R tüvesse piisab, et kahjutu tüvi samuti virulentseks muutuks, kummutades sellega tol ajal laialt levinud arusaama, et valgud on pärilikkust kandvaks materjaliks. DNA hõivamist väliskeskkonnast rakku ja selle arvamist raku enese DNA hulka hakkasid nad nimetama transformatsiooniks. Algul suhtuti nende avastusse küll suure umbusuga, kuid geneetiliste markerite kasutuselevõtt ja teiste geneetilise materjali ülekandemeetodite avastamine Joshua Lederbergi poolt [2] (konjugatsioon 1947. ja transduktsioon 1953. aastal) veenis teaduskogukonda Avery tulemusi tunnustama.

Siiski oldi üsna veendunud, et Escherichia coli ei ole transformatsioonialdis. Alles aastal 1970 näitasid Morton Mandel ja Akiko Higa [3], et kaltsiumkloriidi lahusega töötlemise tagajärjel on E. coli võimeline väliskeskkonnast ilma faagi abita bakteriofaagi DNA-d inkorporeerima. Paar aastat hiljem tõestasid Stanley Cohen, Annie Chang ja Leslie Hsu,[4] et sarnane meetod on efektiivne ka plasmiidse DNA puhul. Mandeli ja Higa meetodit arendas hiljem edasi Douglas Hanahan.[5] Kunstlikult tekitatud kompetentsuse võimalikkus E. coli kui laialdaselt kasutatava mudelorganismi puhul pani aluse mugava ja efektiivse metoodika arendamisele bakterite transformeerimiseks, mis võimaldab biotehnoloogias ja teadustöös kasutada varasemast oluliselt lihtsamaid molekulaarse kloneerimise võtteid. Praeguseks on transformatsiooni näol tegu igapäevase laboriprotseduuriga.

Transformatsioon elektroporatsiooni teel arendati välja 1980. aastate lõpul, tuues kaasa in-vitro transformatsiooni efektiivsuse tõusu ja võimaluse enamate bakteritüvede transformatsiooniks.[6] Uuriti ka taime- ja loomarakkude transformeerimise võimalusi, mis päädis esimese transgeense hiire loomisega aastal 1982, süstides hiire embrüosse geeni roti kasvuhormooni jaoks.[7] Varajastel 1970. aastatel avastati, et Ti-plasmiid Agrobacterium tumefaciensi rakkudes on põhjuseks, miks antud bakter taimedele kasvajaid tekitab.[8] Ti-plasmiid integreerub taime genoomi [9] , kutsudes esile tuumorite teket. Asendades Ti-plasmiidis kasvajat tekitava geeni mõne muu huvipakkuva geeniga, on võimalik A. tumefaciensiga taimi nakatades kaheiduleheliste taimede genoomi viia valitud DNA. Üheiduleheliste ja mõningate teiste A. tumefaciensi suhtes tundetute taimede transformatsiooniks kasutatakse elektroporeerimist ning mikro-injektsiooni [10] Biolistilise meetodi ehk raku pommitamise geneetilise materjaliga kaetud metalliioonidega võttis 1990 aastal kasutusele John Stanford.[11]

Mehhanismid[muuda | redigeeri lähteteksti]

Bakterid[muuda | redigeeri lähteteksti]

Bakterite puhul mõistetakse transformatsiooni all püsivat muutust, mida on toonud kaasa vaba DNA hõivamine väliskeskkonnast rakku ja kompetentsuse all peetakse silmas võimet vaba DNA-d rakuvälisest keskkonnast rakku võtta. Kompetentsus võib olla nii loomulik kui kunstlik.

Looduslik kompetentsus[muuda | redigeeri lähteteksti]

Umbes 1% bakteriliikidest on loomulikult kompetentsed, olles võimelised laborikeskkonnas ilma lisatöötluseta vaba DNA-d oma rakku võtma. On alust arvata, et looduslikus keskkonnas on see protsent suurem. Kui DNA kandub üle ühelt bakteritüvelt teisele, nimetatakse seda horisontaalseks geeniülekandeks, mis on geneetilise materjali saamine teiselt organismilt, olemata selle järglane.[12] Lähedaste liikide vahel toimib transformatsioon paremini kui evolutsiooniliselt kaugemate liikide puhul. Looduslikult kompetentsetes bakterites on olemas geenikomplektid, mis kodeerivad DNA transmembraanseks transpordiks vajalikke valke, näiteks DNA translokaasi komplekse tsütoplasmamembraanis [13] ja tüüp IV kiudude kokkupanekuks tarvilikke valke.

Tulenevalt Gram-positiivsete ja Gram-negatiivsete bakterite rakumembraani erinevustest esineb mõningaid erinevusi viisis, kuidas täpselt bakterid rakuvälist DNA-d enda sisse toovad, kuid üldjoontes on protsess siiski sarnane. Esmalt seondub DNA kompetentse raku pinnal paiknevale DNA retseptorile ning liigub DNA translokaasi abil läbi rakumembraani.[14] Selle käigus lagundatakse selle üks ahel nukleaaside poolt, kuna rakku pääseb vaid üheahelaline DNA. Sellist üheahelalist DNA-d on RecA ehk rekombinaas A abil võimalik genoomi integreerida. Gram-negatiivsed bakterid vajavad oma rakukesta mitmekihilise ehituse tõttu valgulist kanalit ka välisesse membraani, mille moodustavad sekretiinid. Arvatakse ka, et oma roll on piliinil, kuid selle funktsiooni kohta pole veel kuigi palju teada.[15] DNA transport rakku pole enamasti järjestuse-spetsiifiline, ent mõnede liikide puhul võivad kindlad järjestused rakuvälises DNA-s seda kergendada.[16]

Kunstlik kompetentsus[muuda | redigeeri lähteteksti]

Kunstliku kompetentsuse tekitamiseks on kaks enamlevinud meetodit: elektroporatsioon ja rakkude manipuleerimine temperatuuri ning soolalahuse abil. Mõlemad neist muudavad rakuseina DNA-le passiivselt läbitavaks looduses harilikult mitteilmnevate keskkonnategurite mõjul.[17]

Elektroporatsiooni käigus antakse bakterirakkude lahusele, kuhu on lisatud soovitav plasmiid, elektrilöök, mis perforeerib nende rakuseina, et plasmiidne DNA siseneda saaks. Peale elektriväljale eksponeerimist parandavad raku membraaniparandusmehhanismid augud taas väledasti ära. Tegu on rakusõbralikuma meetodiga kui soolalahuse kasutamine, kuna rakud viibivad stressitekitavates tingimustes palju lühemat aega. Kasutatava elektrivälja tugevus jääb tavaliselt vahemikku 10–20 kV/cm.

Keemilisi kompetente hoitakse mõnda aega jää peal kahevalentsete katioonidega soolalahuses, enamasti on selleks kaltsiumkloriidi lahus, misjärel vapustatakse neid kiire lühiajalise kuumutamisega. Arvatakse, et soolalahuse positiivsed ioonid aitavad bakterikesta negatiivselt laetud pinnamolekule neutraliseerida, muutmaks membraani negatiivselt laetud DNA jaoks paremini läbitavaks. Kuumašokk on vajalik selleks, et tekitada temperatuurierinevus raku sise- ja väliskeskkonnas, mis sunnib DNA läbi kahjustatud membraani rakku sisenema.

Taimed[muuda | redigeeri lähteteksti]

DNA viimiseks taimedesse on mitmeid mehhanisme. Lihtsaim neist on transformatsioon Agrobacterium tumefaciensi abil. Selleks lõigatakse taime kude, milleks tavaliselt on leht, väikesteks tükkideks ja leotatakse umbes kümme minutit Agrobacteriumi sisaldavas suspensioonis. Servmised rakud, mis asuvad lõikepinnal, saavad bakteri poolt transformeeritud. Kui selliselt töödeldud koetükid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel üles kasvatada, saadakse geneetiliselt teisenenud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele külvata. Paljusid taimeliike antud meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Väga suur osa taimedes on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembrüosse. Efektiivsus on sel meetodil küll madalam kui Agrobacteriumi kasutades, kuid võimalike mõjustatavate taimede valik on oluliselt laiem. Samuti on suureks eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsion, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.

Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete taimeviiruste abil, kuid see pole transformatsioon, vaid transduktsioon — rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal tsütoplasmas replitseerub, siis enamasti saab sel moel mõjustada vaid üht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestatud geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised kromosoomidega rekombineeruma, tekitades taime genoomis püsivaid muutusi, mistõttu kandub selline ümberkorraldus üle ka järglastele.

Loomad[muuda | redigeeri lähteteksti]

DNA viimist loomsetesse rakkudesse nimetatakse harilikult transfektsiooniks. Ka sel puhul muudetakse rakusein erinevate võtete abil auklikuks, et soovitud materjal rakku liikuda saaks. Transfektsioon ei tähenda ainult DNA viimist rakku, selleks võib olla näiteks siRNA konstrukt või valk nagu antikeha. Transfekteerimiseks kasutatakse kaltsiumfosfaati, elektroporatsiooni või segatakse rakku viidav aine katioonsete lipiididega, moodustamaks liposoome, mis membraaniga kokku sulades sisaldise rakku viivad.

Praktilisi külgi molekulaarbioloogias[muuda | redigeeri lähteteksti]

Kunstliku kompetentsuse tekitamine bakterites annab hea võimaluse DNAga manipuleerimiseks ja valkude ekspressiooniks. Levinuimaks mudelorganismiks on Escherichia coli, keda enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku püsimajäämiseks olema oma replikatsiooni alguspunkt, et teda genoomist sõltumatult paljundada saaks. Transformatsiooniefektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d üles korjavad, mõõtühikuks on CFU/μg DNA kohta.

CFU ehk colony forming unit väljendab eluvõimeliste rakkude hulka näites milliliitris lahuses. Väikese plasmiidi, nagu pUC19, puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1×108 cfu/μg seda, et umbes 1 plasmiid 2000 hulgast läheb rakku sisse. Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal külmas CaCl2 lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42 °C juures sõltuvalt metoodikast 30–120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks keskmiselt 106–107 transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.

Transformatsiooni efektiivsus väheneb plasmiidi suuruse kasvades, mistõttu kasutatakse suuremate DNA molekulide puhul elektroporatsiooni.[18] Elektroporeeritavaid rakke on enne töötlust soovitatav pesta külma mitmekordselt destilleeritud veega, eemaldamaks laetud osakesi, mis protsessi käigus sädet anda võiksid.

Vaata ka[muuda | redigeeri lähteteksti]

Viited[muuda | redigeeri lähteteksti]

  1. [Alberts, Bruce; et al. (2002). Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science. p. G:35. ISBN 9780815340720.].
  2. [Lederberg, Joshua (1994). The Transformation of Genetics by DNA: An Anniversary Celebration of AVERY, MACLEOD and MCCARTY(1944) in Anecdotal, Historical and Critical Commentaries on Genetics. The Rockfeller University, New York, New York 10021-6399. PMID 8150273].
  3. [Mandel, Morton; Higa, Akiko (1970). "Calcium-dependent bacteriophage DNA infection". Journal of Molecular Biology 53 (1): 159–162. doi:10.1016/0022-2836(70)90051-3. PMID 4922220].
  4. [Cohen, Stanley; Chang, Annie and Hsu, Leslie (1972). "Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences 69 (8): 2110–4. doi:10.1073/pnas.69.8.2110. PMC 426879. PMID 4559594].
  5. [Hanahan, D. (1983). "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids". Journal of molecular biology 166 (4): 557–580. doi:10.1016/S0022-2836(83)80284-8. PMID 6345791].
  6. [Wirth, Reinhard; Friesenegger, Anita and Fiedlerand, Stefan (1989). "Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation"].
  7. [Palmiter, Richard; Ralph L. Brinster, Robert E. Hammer, Myrna E. Trumbauer, Michael G. Rosenfeld, Neal C. Birnberg & Ronald M. Evans (1982). "Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein−growth hormone fusion genes". Nature 300 (5893): 611–5. doi:10.1038/300611a0. PMID 6958982].
  8. [Nester, Eugene. "Agrobacterium: The Natural Genetic Engineer (100 Years Later)". Retrieved 14 January 2011].
  9. [Zambryski, P.; Joos, H.; Genetello, C.; Leemans, J.; Montagu, M. V.; Schell, J. (1983). "Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity". The EMBO journal 2 (12): 2143–2150. PMC 555426. PMID 16453482].
  10. [Peters, Pamela. "Transforming Plants – Basic Genetic Engineering Techniques". Retrieved 28 January 2010].
  11. [Voiland, Michael; McCandless, Linda. "DEVELOPMENT OF THE "GENE GUN" AT CORNELL". Retrieved 28th january 2010.].
  12. Horisontaalne geeniülekanne.
  13. [Chen I, Dubnau D (2004). "DNA uptake during bacterial transformation". Nat. Rev. Microbiol. 2 (3): 241–9. doi:10.1038/nrmicro844. PMID 15083159].
  14. [Lacks, S.; Greenberg, B.; Neuberger, M. (1974). "Role of a Deoxyribonuclease in the Genetic Transformation of Diplococcus pneumoniae". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 71 (6): 2305–2309. PMC 388441. PMID 4152205].
  15. [Long, C. D.; Tobiason, D. M.; Lazio, M. P.; Kline, K. A.; Seifert, H. S. (2003). "Low-Level Pilin Expression Allows for Substantial DNA Transformation Competence in Neisseria gonorrhoeae". Infection and immunity 71 (11): 6279–6291. PMC 219589. PMID 14573647].
  16. [Sisco, K. L.; Smith, H. O. (1979). "Sequence-specific DNA uptake in Haemophilus transformation". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76 (2): 972–976. PMC 383110. PMID 311478. editFull text at PMC: / 383110].
  17. [Large-volume transformation with high-throughput efficiency chemically competent cells. Focus 20:2].
  18. [Transformation efficiency of "'E. coli'" electroporated with large plasmid DNA. Focus 20:3 (1998)].