Pöördtranskriptaas

Allikas: Vikipeedia

Pöördtranskriptaas on ensüüm, mille abil saadakse RNA referentsahelalt sünteesida komplementaarne DNA (cDNA) ahel. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks, enim seostatakse seda retroviirustega. Lisaks neile kasutavad pöördtranskriptaasi ka mõned muud viirused, näiteks hepatiit B viirus, mis kuulub hepadnaviridaede hulka. Pöördtranskriptaasi inhibiitoreid kasutatakse laialdaselt antiretroviraalsete ravimitena. Seda on seostatud ka kromosoomide lõppude replikatsiooniga ning osade mobiilsete geneetiliste elementidega (retrotransposoonid).

Retroviraalne pöördtranskriptaas viib läbi kolme järjestikust biokeemilist tegevust:[1]

  1. RNA-sõltuv DNA polümeraasi aktiivsus
  2. ribonukleaas H
  3. DNA-sõltuv DNA polümeraasi aktiivsus

Retroviirus kasutab neid tegevusi üheahelalise genoomse RNA muutmiseks kaheahelaliseks cDNAks, mida on võimalik integreerida peremeesorganismi genoomi ning võib nii põhjustada pikaajalise infektsiooni, millest on raske vabaneda. Seda mehhanismi kasutatakse laialdaselt laborites RNA muutmiseks DNAks molekulaarses kloneerimises, RNA sekveneerimises, polümeraasiahelreaktsioonis (PCR) või genoomses analüüsis. Enim uuritud pöördtranskriptaasid:

  • HIV-1 pöördtranksriptaas inimese immuunpuudulikkuse tüüp 1 viiruselt (PDB: 1HMV), koosneb kahest subühikust molekulmassidega 66 ja 51kDa[2]
  • M-MLV pöördtranskriptaas Moloney hiire leukeemia viirusest, mis on üksik 75kDa monomeer[3]
  • AMV pöördtranskriptaas linnu müeloblastoosi viirusest, koosneb kahest subühikust molekulmassidega 63kDa ja 95kDa
  • Telomeraasi pöördtranskriptaas, mis takistab kromosoomi otsade lagunemist pärast mitmeid replikatsioone

Ajalugu[muuda | muuda lähteteksti]

Pöördtranskriptaasi avastas Howard Temin Wisconsini ülikoolis RSV virionidest[4], selle isoleeris iseseisvalt David Baltimore 1970. aastal MITs kahest RNA kasvajaviirustest R-MLV ja samuti RSV[5]. Nende saavutuste eest anti neile ühine Nobeli auhind 1975. aastal füsioloogia või meditsiini kategoorias (koos Renato Dulbeccoga). Alguses oli idee pöördtranskriptsioonist väga ebapopulaarne, kuna see oli vastuolus molekulaarbioloogia keskse dogmaga, mis väidab, et DNAd transkribeeritakse RNAks ning see omakorda valguks. Alles 1970. aastal, mil Temin ja Baltimore avastasid pöördtranskriptsiooni eest vastutava ensüümi (pöördtranskriptaasi), hakati aktsepteerima ideed, et informatsiooni on võimalik muuta ka RNAst DNAks.[6]

Funktsioon viirustes[muuda | muuda lähteteksti]

Pöördtranskriptaasi kodeeritakse ja kasutatakse pöördtranskribeerivate viiruste poolt, mis kasutavad ensüümi replikatsiooni käigus. Pöördtranskribeerivad RNA viirused (retroviirused) kasutavad ensüümi, et pöördtranskribeerida oma RNA genoom DNAks, mida on võimalik seejärel integreerida peremeesorganismi ning läbi selle replitseerida. Pöördtranskribeerides DNA viirusi, näiteks hepadnaviirust, on võimalik kasutada RNAd matriitsahelana (template) uute DNA ahelate kokkupanemisel ja loomisel. HIV nakatab inimest kasutades seda ensüümi. Kui puuduks pöördtranskriptaas, siis ei saaks viiruse pärilikkusmaterjal integreeruda peremeesorgansimi genoomi. Selle tagajärjeks oleks viiruse võimetus replitseeruda.[7]

Pöördtranskriptsiooni protsess[muuda | muuda lähteteksti]

Pöördtranskriptaas loob kaheahelalise DNA RNA matriitsahelalt. Viiruse liikides, kus pöördtranskriptaasil on puudulik DNA-sõltuv DNA polümeraasiaktiivsus, on võimalus, et kaheahelalist DNAd sünteesitakse peremeesorganismi kodeeritud DNA polümeraas δ abil. See toimib, kuna polümeraas ekslikult tuvastab viraalse DNA-RNA kui praimeri ning sünteesib kaheahelalise DNA samal mehhanismil nagu praimeri eemaldamiselgi, kus uus sünteesitud ahel vahetab välja originaalse RNA matriitsi. Pöördtranskriptsiooni puhul on vigade tekkimise tõenäosus suur. See on põhiline reaktsioon, mille käigus võivad tekkida mutatsioonid, mille tulemuseks on viiruse resistentsus ravimile.[8]

Retroviiruste pöördtranskriptsioon[muuda | muuda lähteteksti]

Retroviirused, mida kutsutakse ka klass VI ssRNA-RT viirusteks, on RNAd pöördtranskribeerivad viirused DNA vaheetapiga. Nende genoom koosneb kahest positiivse laenguga üheahelalisest RNA molekulist, millel on 5’-cap ja 3’-polüadenenüleeritud saba. Retroviirusteks on näiteks inimese immuunpuudulikkuse viirus (HIV) ja inimese T-lümfotroofne viirus (HTLV). Kaheahelalise DNA süntees toimub tsütosoolis[7] järgmiste protsesside tulemusena:

Pöördtranskriptsiooni mehhanism VI klassi ssRNA-RT HI-viiruses
  1. Spetsiifiline tRNA käitub kui praimer ning hübridiseerub viiruse RNA genoomi komplementaarsesse piirkonda, mida kutsutakse praimeri seondumiskohaks (PBS – primer binding site)
  2. Komplementaarne DNA seondb seejärel viraalse RNA U5 (mittekodeeriv regioon) ja R regiooni (otsesed kordused leiduvad mõlemas RNA molekuli otsas)
  3. Pöördtranskriptaasi ensüümi domeen nimega RNaas H lagundab RNA 5’-otsa, mis eemaldab U5 ja R regiooni
  4. Praimer “hüppab” viraalse genoomi 3’-otsa ning äsja sünteesitud DNA ahelad hübridiseeruvad RNAl olevasse komplementaarsesse R regiooni
  5. Pikendatakse esimest komplementaarse (DNA) ahelat, enamus viraalsest RNAst lagundatakse RNaas H abil
  6. Kui ahela süntees on lõpetatud, algatab viraalne RNA teise ahela sünteesi
  7. Toimub järjekordne “hüpe”, kus PBS teiselt ahelalt hübridiseerub komplementaarse PBSiga esimeselt ahelalt
  8. Mõlemaid ahelaid pikendatakse ning neid on võimalik sisestada peremeesorganismi genoomi integraasi ensüümi abil

Kaheahelalise DNA süntees kaasab ka ahela ülekannet, kus lühike DNA produkt translokeerub algse RNA-sõltuva DNA sünteesi ajal aktseptormatriitsi regiooni genoomi lõpus. Seda ala hiljem töötleb pöördtranskriptaas tänu oma DNA-sõltuvale DNA aktiivsusele.[8] Retroviraalset RNAd korrastatakse 5’-otsas ja 3’-otsas. Ala, kuhu praimer seondub viraalsel RNAl nimetatakse praimerit siduvaks alaks (PBS). U5 on PBS ala RNA 5’-otsas ning juhtivaks kutsutakse PBSi RNA 3’-otsas. tRNA praimer ei seondu 14. ja 22. nukleotiidi vahel ning loob aluspaarduva dupleksi viraalse RNAga PBS alas. PBS asukoht 5’-otsa piirkonnas viraalsel RNAl on ebatavaline, kuna pöördtranskriptaas sünteesib DNAd praimeri 3’-otsast 5’-3’-suunas (vaadeldes RNA matriitsi). Seega praimer ja pöördtranksriptaas peavad olema relokeerunud 3’-otsa viraalsel RNAl. Selleks ümberpaigutumiseks on vaja mitut etappi ja erinevaid ensüüme, sh DNA polümeraas, ribonukelaas H (RNaas H) ja polünukleotiidide lahtikeerdumine.[9][10]

HIVi pöördtranskriptaas omab samuti ribonukleaasset aktiivsust, mis lagundab viraalse RNA cDNA sünteesi käigus. Lisaks on sellel pöördtranskriptaasil DNA-sõltuva DNA polümeraasi aktiivsus, mis kopeerib sense cDNA ahela antisense DNAks, et luua kaheahelaline viraalne DNA vaheühend (vDNA).[11]

Viited[muuda | muuda lähteteksti]

  1. Tu X, Das K, Han Q, Bauman JD, Clark AD, Hou X, Frenkel YV, Gaffney BL, Jones RA, Boyer PL, Hughes SH, Sarafianos SG, Arnold E (September 2010). "Structural basis of HIV-1 resistance to AZT by excision.". Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (10): 1202–9. PMC 2987654 Freely accessible. PMID 20852643. doi:10.1038/nsmb.1908.
  2. Ferris, AL; Hizi, A; Showalter, SD; Pichuantes, S; Babe, L; Craik, CS; Hughes, SH (April 1990). "Immunologic and proteolytic analysis of HIV-1 reverse transcriptase structure." (PDF). Virology. 175 (2): 456–64. PMID 1691562. doi:10.1016/0042-6822(90)90430-y.
  3. Konishi A, Yasukawa K, Inouye K (2012). "Improving the thermal stability of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase α-subunit by site-directed mutagenesis". Biotechnol. Lett. 34 (7): 1209–15. PMID 22426840. doi:10.1007/s10529-012-0904-9
  4. Temin H. M., Mizutani S. (June 1970). "RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus". Nature. 226 (5252): 1211–3. PMID 4316301. doi:10.1038/2261211a0.
  5. Baltimore D. (June 1970). "RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses". Nature. 226 (5252): 1209–11. PMID 4316300. doi:10.1038/2261209a0.
  6. Central dogma reversed". Nature. 226 (5252): 1198–9. June 1970. PMID 5422595. doi:10.1038/2261198a0.
  7. 7,0 7,1 Bio-Medicine.org - Retrovirus Retrieved on 17 Feb, 2009
  8. 8,0 8,1 Telesnitsky A., Goff S. P. (1993). "Strong-stop strand transfer during reverse transcription". In Skalka, M. A.; Goff, S. P. Reverse transcriptase (1st ed.). New York: Cold Spring Harbor. p. 49. ISBN 0-87969-382-7.
  9. Bernstein A., Weiss R., Tooze J. (1985). "RNA tumor viruses". Molecular Biology of Tumor Viruses (2nd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory.
  10. Moelling, K; Broecker F. (2015) The reverse transcriptase–RNase H: from viruses to antiviral defense. Ann N Y Acad Sci. 1341:126-35. doi: 10.1111/nyas.12668.
  11. Doc Kaiser's Microbiology Home Page > IV. VIRUSES > F. ANIMAL VIRUS LIFE CYCLES > 3. The Life Cycle of HIV Community College of Baltimore County. Updated: Jan 2008.