Kasutaja:Lleas/RecBCD

Allikas: Vikipeedia
Jump to navigation Jump to search

RecBCD (E. coli exonuclease V) on ensüümkompleks, mis E. coli bakteris algatab rekombinatsioonilise DNA reparatsiooni. Ensüüm on võimeline parandama kaheahelalisi katkeid, mis võivad tekkida näiteks ioniseeriva radiatsiooni, replikatsioonivigade, endonukleaaside tegevuse tulemusena, oksüdatiivse kahjustuse või muude faktorite tõttu.[1] RecBCD omab kahte põhilist funktsiooni: ta käitub üheaegselt helikaasina, mis keerab DNA ahelad lahti ning eraldab need üksteisest ning nukleaasina, mis teeb DNAsse üheahelalisi katkeid.[2]

Struktuur[muuda | muuda lähteteksti]

Ensüümkompleks koosneb kolmest alaühikust: RecB, RecC ja RecD. Sellest tulenevalt on kompleks saanud ka oma nime. Enne recD geeni avastamist tunti kompleksi „RecBC“ nime all.[3] Iga alaühik sünteesitakse vastavalt geenilt.

Funktsoon[muuda | muuda lähteteksti]

Joonis 1 RecBCD homoloogilise rekombinatsiooni rada olukorras kus ATP on ülekaalus.

Nii RecB kui ka RecD on mõlemad helikaasid ehk ATP-sõltuvad molekulaarsed mootorid, mis harutavad DNA ahelaid üksteisest lahku. RecB alaühik toimib lisaks sellele ka nukleaasina. RecBCD kompleks (võib-olla ka vaid RecC alaühik) tunneb ära spetsiifilise DNA järjestuse, 5'-GCTGGTGG-3', mida nimetatakse Chi-järjestuseks (Crossover hotspot instigator) ning tähistatakse kreeka tähega χ.[4] Chi-järjestused on sellised järjestused bakteri genoomis, mille lähedal toimub suurema tõenäosusega homoloogiline rekombinatsioon.[5] RecD puhul on ka jälgitud, et enne ensüümkompleksi Chi-funktsionaalsuse saavutamist inhibeerib ta RecA seondumist. Seetõttu on homoloogilise rekombinatsiooni jätkumiseks vajalik RecD konformatsiooniline muutus.[6]

RecBCD on helikaaside hulgas omapärane, kuna kompleksis on kaks helikaasi, mis liiguvad erineva kiirusega[7] ning need tunnevad ära Chi-järjestuse, mis võib nende struktuuri muuta.[8][9] RecBCD seondub lineaarse kaheahelalise DNA otsa. Seejärel liigub RecD helikaas mööda 5' otsaga ahelat, kust algatatakse ahelate lahti harutamine. RecB teeb sama 3' otsaga ahelal. Kuna RecB töötab aeglasemalt kui RecD, kuhjub üheahelaline DNA RecB ette (Joonis 1). Selle tulemusena tekivad DNA struktuurid kahe üheahelalise sabaga (lühem 3' otsaga saba ja pikem 5' otsaga saba) ja üheahelalise silmusega 3' otsaga ahelas. Neid struktuure on nähtud elektronmikroskoobi abil.[10]

Mehhanism[muuda | muuda lähteteksti]

DNA molekuli lahti harutamisel võib RecB toimida mitut moodi vastavalt keskkonnas olevatele ainetele, ennekõike Mg2+ ioonide ja ATP kontsentratsioonide suhtele. Kui ATP-d on liias siis ensüüm lõikab katki vaid ahela, millel asub Chi-järjestus (järjestus, mis oli algselt 3' otsaks) (Joonis 1).[11] Ahelate lahti harutamine jätkub ning tekib üksik 3' otsaga ahel, mille tipus on ka Chi-järjestus. See saba saab seostuda RecA valguga, mis viib läbi ahelate vahetust terve homoloogse DNA ahelaga ehk rekombinatsiooni.[12] Kui RecBCD jõuab ahela lõppu, lasevad ensüümkompleksi alaühikud ahelast ning üksteisest lahti ning ensüüm jääb inaktiveerituks vähemalt tunniks.[13] RecBCD molekul, mis käitus nagu Chi, ei seondu mõnele teisele DNA molekulile.

Keskkonnas, kus Mg2+ ioonid on liias, lõikab RecBCD ensüüm mõlemad DNA ahelad endonukleaasselt, kuigi 5' saba lõigatakse harvemini kui 3' saba (Joonis 2).[14] Kui RecBCD satub 3' otsaga ahelal Chi-järjestusele, siis ahelate lahti harutamine peatub ning 3' otsaga ahela töötluse kiirus väheneb.[15] Lahti harutamise jätkudes lõhutakse nüüd vastasahelat (5' otsaga ahelat)[16][17] ning RecA valk laetakse 3' otsaga ahelale.[13] Peale ühe DNA molekuli protsessimise lõppu jätkab ensüümkompleks koheselt tööd mõne teise DNA molekuliga, kus viiakse läbi sama protsess.

Joonis 2 RecBCD raja homoloogilise rekombinatsiooni algus olukorras, kus Mg2+ on ülekaalus.

Rakusisese DNA puhul ei ole kumbagi eelmainitud protsessi veel katsete analüüsi kaudu tuvastatud, kuna nende toimumise kiirus on vaatlemiseks liiga suur. Sellele vaatamata viitavad geneetilised tõendid asjaolule, et reaalselt toimib RecBCD abil läbi viidav rakusisene DNA töötlus pigem selliselt, nagu on täheldatud ATP liias toimuva protsessiga.[2] Näiteks need RecBCD mutandid, kel puudub tuvastatav endonukleaasne aktiivsus, säilitavad rakkudes kõrge Chi aktiivsuse.[18] Chi saidi olemasolu ühel DNA molekulil rakus vähendab või eemaldab Chi aktiivsuse teistel DNA molekulidel, seda tõenäoliselt seetõttu, et Chi-sõltuv RecBCD lagundamist on täheldatud in vitro keskkonnas, kus on ATP-d liias ning seetõttu lõigatakse DNA-d Chi saidis.[19][20]

Mõlemal tingimusel jääb 3' otsaga ahel Chi saidist allapoole terveks. Seejärel laetakse RecA valk RecBCD abil aktiivselt 3' otsa. Teatud ajahetkel (mida pole siiani veel kindlaks tehtud) laseb RecBCD DNA molekulist lahti. Ensüümkompleks on võimeline lahti harutama vähemalt 60 kb jagu DNA ahelat ilma sellelt lahti tulemata. RecA algatab DNA ahelate vahetuse selle ahela, millele ta on seotud ja mõne identse või peaaegu identse terve DNA ahela vahel. Selle tulemusena tekib liidetud DNA molekul, mis arvatavasti omakorda korrigeeritakse kas replikatsiooni abil (mis saab alguse 3' otsaga ahela pealt, mis sisaldab Chi-järjestust) või siis Holliday ühenduse tekitamise kaudu. Holliday ühendus muudetakse lineaarseks DNA molekuliks tänu RuvABC kompleksile või harutatakse see lahti RecG valgu abil. Mõlemal juhul luuakse terviklikud DNA molekulid kus on järjestus muutunud võrreldes esialgse järjestusega. See protsess, mida tuntakse ka homoloogilise rekombinatsiooni all, lõpetab DNA reparatsiooni kaheahelalise katke puhul.[13]

In vivo keskkonnas läbi viidud katsed viitavad samuti asjaolule, et RecBCD raja käigus toimuv DNA protsessimine toimub võrdlemisi kiiresti. DNA ahela töötluse kiirus bakterites on umbkaudu 1,6 kb/s ning see sõltub ka temperatuurist.[21]

Rakendused[muuda | muuda lähteteksti]

RecBCD on mudelensüüm, mille abil on võimalik uurida üksiku molekuli fluorestsentsi. Tegu on eksperimentaalse meetodiga, mille abil on võimalik uurida ja paremini mõista valgu-DNA interaktsioone.[22] Ensüüm on samuti kasulik lineaarse üksik- või kaksikahelalise DNA eemaldamisel DNA rõngasmolekulide preparaatidest, kuna kompleks vajab funktsioneerimiseks lahtist DNA otsa.

Viited[muuda | muuda lähteteksti]

  1. Smith, GR (June 2012). "How RecBCD Enzyme and Chi Promote DNA Break Repair and Recombination: a Molecular Biologist's View". Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2): 217–28. PMID 22688812. doi:10.1128/MMBR.05026-11 [1]
  2. 2,0 2,1 Singleton MR, Dillingham MS, Gaudier M, Kowalczykowski SC, Wigley DB (November 2004). "Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks". Nature. 432 (7014): 187–93. PMID 15538360. doi:10.1038/nature02988 [2]
  3. Amundsen SK, Taylor AF, Chaudhury AM, Smith GR (August 1986). "recD: the gene for an essential third subunit of exonuclease V.". Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (15): 5558–62. PMC 386327 Freely accessible. PMID 3526335. doi:10.1073/pnas.83.15.5558 [3]
  4. Yu M, Souaya J, Julin DA (February 1998). "The 30-kDa C-terminal domain of the RecB protein is critical for the nuclease activity, but not the helicase activity, of the RecBCD enzyme from Escherichia coli". Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (3): 981–6. doi:10.1073/pnas.95.3.981. PMC 18645 . PMID 9448271.
  5. Smith GR. (2012). How RecBCD Enzyme and Chi Promote DNA Break Repair and Recombination: a Molecular Biologist's View. Microbiol Mol Biol Rev. 76(2): 217-28. PMID 22688812
  6. Susan K. Amundsen, Andrew F. Taylor, and Gerald R. Smith (Aprill 2000). "The RecD subunit of the Escherichia coli RecBCD enzyme inhibits RecA loading, homologous recombination, and DNA repair". Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 20;97(13):7399-404. PMID: 10840065. PMCID: PMC16557. DOI: 10.1073/pnas.130192397.
  7. Taylor AF, Smith GR (June 2003). "RecBCD enzyme is a DNA helicase with fast and slow motors of opposite polarity". Nature. 423 (6942): 889–93. doi:10.1038/nature01674. PMID 12815437.
  8. Taylor AF, Smith GR (June 1992). "RecBCD enzyme is altered upon cutting DNA at a Chi recombination hotspot". Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (12): 5226–30. doi:10.1073/pnas.89.12.5226. PMC 49264 . PMID 1535156.
  9. Amundsen SK, Taylor AF, Reddy M, Smith GR (December 2007). "Intersubunit signaling in RecBCD enzyme, a complex protein machine regulated by Chi hot spots". Genes Dev. 21 (24): 3296–307. doi:10.1101/gad.1605807. PMC 2113030 . PMID 18079176.
  10. Taylor A, Smith GR (November 1980). "Unwinding and rewinding of DNA by the RecBC enzyme". Cell. 22(2 Pt 2): 447–57. doi:10.1016/0092-8674(80)90355-4. PMID 6256081.
  11. Taylor AF, Schultz DW, Ponticelli AS, Smith GR (May 1985). "RecBC enzyme nicking at Chi sites during DNA unwinding: location and orientation-dependence of the cutting". Cell. 41 (1): 153–63. doi:10.1016/0092-8674(85)90070-4. PMID 3888405.
  12. Anderson DG, Kowalczykowski SC (July 1997). "The translocating RecBCD enzyme stimulates recombination by directing RecA protein onto ssDNA in a Chi-regulated manner". Cell. 90 (1): 77–86. doi:10.1016/S0092-8674(00)80315-3. PMID 9230304.
  13. 13,0 13,1 13,2 Taylor AF, Smith GR (April 1999). "Regulation of homologous recombination: Chi inactivates RecBCD enzyme by disassembly of the three subunits". Genes Dev. 13 (7): 890–900. doi:10.1101/gad.13.7.890. PMC 316601 . PMID 10197988.
  14. Dixon DA, Kowalczykowski SC (April 1993). "The recombination hotspot Chi is a regulatory sequence that acts by attenuating the nuclease activity of the E. coli RecBCD enzyme". Cell. 73 (1): 87–96. doi:10.1016/0092-8674(93)90162-J. PMID 8384931.
  15. Spies M, Amitani I, Baskin RJ, Kowalczykowski SC (November 2007). "RecBCD enzyme switches lead motor subunits in response to Chi recognition". Cell. 131 (4): 694–705. doi:10.1016/j.cell.2007.09.023. PMC 2151923 . PMID 18022364.
  16. Taylor AF, Smith GR (October 1995). "Strand specificity of nicking of DNA at Chi sites by RecBCD enzyme. Modulation by ATP and magnesium levels". J Biol Chem. 270 (41): 24459–67. doi:10.1074/jbc.270.41.24459. PMID 7592661.
  17. Anderson DG, Kowalczykowski SC (March 1997). "The recombination hot spot chi is a regulatory element that switches the polarity of DNA degradation by the RecBCD enzyme". Genes Dev. 11 (5): 571–81. doi:10.1101/gad.11.5.571. PMID 9119222.
  18. Amundsen SK, Smith GR (January 2007). "Chi hotspot activity in Escherichia coli without RecBCD exonuclease activity: implications for the mechanism of recombination". Genetics. 175 (1): 41–54. doi:10.1534/genetics.106.065524. PMC 1774988 . PMID 17110484.
  19. Köppen A, Krobitsch S, Thoms B, Wackernagel W (July 1995). "Interaction with the recombination hot spot Chi in vivo converts the RecBCD enzyme of Escherichia coli into a Chi-independent recombinase by inactivation of the RecD subunit". Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14): 6249–53. doi:10.1073/pnas.92.14.6249. PMC 41495 . PMID 7541534.
  20. Myers RS, Kuzminov A, Stahl FW (July 1995). "The recombination hot spot Chi activates RecBCD recombination by converting Escherichia coli to a recD mutant phenocopy". Proc Natl Acad Sci U S A. 92(14): 6244–8. doi:10.1073/pnas.92.14.6244. PMC 41494 . PMID 7603978.
  21. Jakub Wiktor, Marit van der Does, Lisa Büller, David J Sherratt, Cees Dekker (December 2017). "Direct observation of end resection by RecBCD during double-stranded DNA break repair in vivo". Nucleic Acids Research, gkx1290, https://doi.org/10.1093/nar/gkx1290
  22. Bianco PR, Brewer LR, Corzett M, Balhorn R, Yeh Y, Kowalczykowski SC, Baskin RJ (January 2001). "Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules". Nature. 409(6818): 374–8. doi:10.1038/35053131. PMID 11201750.