DNA-mikrokiiptehnoloogia

Allikas: Vikipeedia
Jump to navigation Jump to search

DNA-mikrokiiptehnoloogia on meetod molekulaarbioloogias, kus tahkele kandjale (milleks võib olla nt klaas, silikoonist Affymetrixi kiip, Illumina platvormi kuulikesed, nailonfilter) on kovalentselt kinnitatud kümneid tuhandeid spetsiifilisi oligonukleotiidseid järjestusi ning neid hübriiditakse kindlate cDNA või cRNA (komplementaarsete DNA või RNA) proovidega.[1]

Komplementaarse DNA mikrokiibid ja oligonukleotiidipõhised mikrokiibid on olulised kiire kvantitatiivse RNA transkriptide (geeni transkriptsioonil moodustuvad RNA molekulid[2]) taseme analüüsiks erinevates bioloogilistes süsteemides.[3]

Tehnoloogia töötati välja 1990. aastatel[4], kuigi juba 1987. aastal kirjeldati kindla DNA järjestuste kasutamist katses, kus tehti kindlaks, milliste geenide ekspressiooni mõjutab interferoon.[5] Neid esimesi katseid tehti kinnitades cDNAd filterpaberile spetsiaalse seadeldisega. Aastaks 1995 võeti kasutusele esimesed tõeliselt väikesed mikrokiibid geeniavaldumise uurimiseks.[6] Mikrokiipe hakati laialdasemalt teaduses kasutama tänu Patrick Brownile ja tema kolleegidele Stanfordi Ülikoolist, Jeffrey Trentile ja kolleegidele Rahvusvahelisest Terviseorganisatsioonist ning paljudele teistele.[7]

DNA-mikrokiipe kasutatakse lisaks bioloogilistes proovides geeniekspressiooni määramisele ka genoomse DNA määramiseks, näiteks polümorfismide, regulatoorse DNA sekventsi, deletsioonide ja kahekordistumiste tuvastamiseks, DNA sekventsi saamiseks, DNA metülatsiooni staatuse kindlakstegemiseks.[8]

Mikrokiiptehnoloogia põhimõte[muuda | muuda lähteteksti]

Laikhübriidimismeetod on levinuim viis geeniekspressiooni uurimiseks.[9] Üheaegselt on võimalik uurida 104–105 oligonukleotiidset proovi. Kandja suurus on seejuures 1...2 cm2. Mikrokiipide kasutamine on muutunud automatiseerituks. Tulemused tehakse kindlaks optiliste meetoditega, sest need on üldjuhul täpsemad kui ülejäänud andmekogumismeetodid. Mõõdetud optilised signaalid kantakse üle arvutiprogrammidesse, kus toimub andmete analüüs.[10]

Mikrokiiptehnoloogial põhinevatest kliinilistest testidest on saanud üks osa haiguste diagnoosimisest ja ravist. Sellised testid on head uurimaks haigusi, millel on komplekssed geneetilised põhjused. Mikrokiiptehnoloogia väljunditeks võiks olla spetsiifilisem ravimite ja ravimite režiimi määramine.[11]

Eelised[muuda | muuda lähteteksti]

  • Kiire – ühe nädala jooksul on võimalik koguda andmeid 20 000 transkripti RNA tasemete kohta.
  • Ülevaatlik – mikrokiibile võib kanda terveid transkriptoome.
  • Paindlik – igale võimalikule geenile vastava cDNA või oligonukleotiidid saab kanda kiibile. Meetodit on võimalik kohandada mikroRNA või metüleeritud DNA uurimiseks.[12]

Puudused[muuda | muuda lähteteksti]

  • Kallis – paljud uurijad leiavad tehnoloogia olevat liiga kalli, et teha piisavalt korduskatseid ja kontrolle, mistõttu katsed jäävad statistiliselt nõrgaks.
  • Ebakindel kvaliteet – pildi- ja andmeanalüüsi kvaliteediga seonduvad probleemid.
  • Tehnilised vead – RNA on kontekstist sõltuv ja vaadeldud erisused võivad tuleneda tehnilistest vigadest (erisus tekib, kuna RNAd käsitses mitu laboranti, päevast, millal RNA eraldati), mitte proovide erinevusest (näiteks normaalne vs mutatsiooniga proov).
  • RNA kasutamine – geeniekspressiooni lõppsaadus on valk, mitte RNA.[12]

Laikhübriidimismeetod[muuda | muuda lähteteksti]

Laikhübriidimismeetodit eelistatakse, sest see ei nõua nii palju kulutusi ja seda on võimalik kergesti kohandada. Meetod teeb võimalikuks uurida geeniekspressiooni kahe erineva seisukorra puhul – näiteks pahaloomuline vs normaalne rakk. Sellistel juhtudel eraldatakse mõlemalt variandilt mRNA, märgistatakse erinevalt ja hübriidiitakse mikrokiibile. Tavalisimaks märgistuseks kasutatavad värvid on fluorestseeruvad Cy3 või Cy5. Hübriiditud kiip skaneeritakse spetsiaalse lugeriga, mis toob nähtavale hübriidunud (fluorestseeruvad) kohad.[13]

Oligonukleotiidi mikrokiip[muuda | muuda lähteteksti]

Kiibile võib siduda cDNA asemel ka oligonukleotiide.[14] See saavutatakse Affymetrixi abil, kasutades modifitseeritud fotolitograafia meetodit.[15] Otse kandja pinnale sünteesitakse lühikesed oligonukleotiidsed sekventsid, mis esindavad kindlat geeni või geeni kokkupõime- ehk splaiss-variante. Sekventsi pikkused võivad varieeruda, olenevalt uurimise eesmärgist.[16]

Katse käik[muuda | muuda lähteteksti]

Tüüpiliselt immobiliseeritakse mitu nanogrammi (10−9 grammi) kindla sekventsiga DNAd kiibi pinnale.[12] Mikrokiiptehnoloogia katsetes immobiliseeritakse DNA kindla mustrina klaas- või kvartskandjale, vahel ka nailon-filtritele. Igal laigul on asukohapõhine indeks.[17] Huvipakkuvatest bioloogilistest allikatest, näiteks metsik-tüüpi või mutantsetest organismidest, eraldatakse RNA.[12] Paljude olemasolevate mikrokiipide jaoks on vaja 1–5 μg RNAd.[18] Sageli muudetakse RNA cDNAks (või ka cRNAks), märgistatakse fluorestseeruva või radioaktiivse markeriga ning hübriiditakse kiibile. RNAst konverteeritud cDNA hübriidub valikuliselt vastavatele nukleiinhapetele mikrokiibi pinnal.[12] Kui märgistatud molekulid hübriiduvad kindlale proovile, siis fluorestseeruv marker muudab proovielemendi fluorestseeruvaks kindla lainepikkusega valguse käes.[17] Fluorestsentsi või radioaktiivsust mõõdetakse spetsiifilise laseraparatuuriga ning seejärel töödeldakse arvutitarkvaraga.[9] Tehakse pildi- ja andmeanalüüs. Selle protsessi kaudu on mikrokiiptehnoloogia abil võimalik üheaegselt mõõta ekspressiooni taset tuhandetes geenides, mis on esindatud mikrokiibil.[12]

Iga uurija ei pea koostama uusi mikrokiipe, vaid neid on võimalik ka osta. Olemas on mikrokiipe, milles on näiteks pärmiseente 6000 geeni, äädikakärbse 14 000 geeni või inimese 23 000 geeni proovid.[9]

Andmete analüüs[muuda | muuda lähteteksti]

Mikrokiiptehnoloogia katse tulemusi analüüsitakse, et tuvastada individuaalseid geene, mis on erinevalt reguleeritud. Samuti püütakse tuvastada laiaulatuslikke mustreid geenide avaldumises.[19] Mikrokiiptehnoloogia tulemuste analüüsiga seostatakse kahte erinevat arvutuslikku probleemi. Esimeseks peab andmetöötlus olema läbi viidud nii, et tulemused kajastaksid täpselt kas absoluutsete transkriptide arvusid rakkudes või nende arvude suhet kahe erineva katsetingimuse korral. Andmetöötluse tulemuseks on geeniekspressiooni maatriks. Üheks võimalikuks vormiks on näiteks järgnev: maatriksis on n rida, millest iga rida vastab geenile või elemendile mikrokiibil ja m veergu, millest iga veerg vastab tunnusele (nt aeg), mille suhtes ekspressiooni mõõdeti. Geeniekspressiooni maatriksil on elemendi sisuks kas fluorestseerumisintensiivsus või kahe fluorestseerumisintensiivsuse suhe. Teiseks probleemiks on intensiivsuse andmete interpretatsioon geeniekspressiooni maatriksis. See on oluline just andmete bioloogilise tausta lahtimõtestamiseks ning võimalike lisakatsete kavandamiseks.[20]

Vaadeldud geeniavaldumise mustrite bioloogilise tausta mõistmine on mikrokiiptehnoloogiat kasutavale teadlasele peamine. Sageli tuginevad uurijad kirjanduse käsitsi läbivaatamisele ja ekspertteadmistele. Mitu tarkvaralahendust pakuvad võimalust andmete koondamiseks. Näiteks andmebaas Database Referencing of Array Genes Online (DRAGON) sisaldab lehekülge, mis võimaldab mikrokiiptehnoloogia andmete annotatsiooni avalikest allikatest (UniGene, Pfam, SwissProt, KEGG) pärit andmetega. Välja on töötatud erinevaid lahendusi andmete annoteerimiseks. Seesugused on näiteks Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID), GenMAPP, SOURCE ja Resourcerer. Microarray Literature-based Annotation (MILANO, 2005) on lahendus, mille abil saab ekspressiooni andmeid annoteerida asjakohase kirjanduse viidetega.[21]

Standardiseerimaks mikrokiiptehnoloogia andmete analüüsi pakkusid Brazma ja kolleegid 17 institutsioonist välja süsteemi mikrokiiptehnoloogia andmete kogumiseks ja jagamiseks. MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment) pakub teaduritele raamistikku, kirjeldamaks informatsiooni kuues valdkonnas: katse kuju, mikrokiibi tüüp, proovid ja kuidas neid töödeldi, hübriidimisprotsess, pildianalüüs, normalisatsiooniks kasutatud kontrollid.[22] [1]

Andmebaasid[muuda | muuda lähteteksti]

Nii töötlemata kui ka töödeldud andmed hoiustatakse pärast publitseerimist avalikesse varamutesse. Kaks peamist varamut on ArrayExpress Euroopa Bioinformaatika Instituudis ja Gene Expression Omnibus (GEO) NCBI-s. Lisaks on veel muid andmete hoiustamise lahendusi, näiteks BioMart ja InterMine. Sellised lahendused toetavad andmete analüüsi ja on loodud erinevate andmestike lõimimiseks.[23] [2]

Viited[muuda | muuda lähteteksti]

  1. Ain Heinaru, 2012, Geneetika, Eesti, Tartu Ülikooli Kirjastus, lk 983.
  2. Ain Heinaru, 2012, Geneetika, Eesti, Tartu Ülikooli Kirjastus, lk 1084
  3. Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 322
  4. Ain Heinaru, 2012, Geneetika, Eesti, Tartu Ülikooli Kirjastus, lk 691
  5. D.A. Kulesh, D.R. Clive, D.S. Zarlenga, J.J. Greene Identification of interferon-modulated proliferation-related cDNA sequences, USA, Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (23): 8453–8457, 1987.
  6. M. Schena, D. Shalon, R.W. Davis, P.O. Brown Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray Science 270 (5235): 467–470, 1995.
  7. J. DeRisi, et al. "Use of cDNAmicroarray to analyze gene expression patterns in human cancer", Nat. Genet. 14, 457–460, 1996
  8. Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 369
  9. 9,0 9,1 9,2 Ain Heinaru, 2012, Geneetika, Eesti, Tartu Ülikooli Kirjastus, lk 343
  10. Richard C. Deonier, Simon Tavaré, Michael S. Waterman, 2005, Computational Genome Analysis: an Introduction, USA, Springer Science+Business Media, LLC, lk 298.
  11. Xinmin Li, R. J. Quigg, J. Zhou, Weikuan Gu, P Nagesh Rao, and E. F. Reed Clinical Utility of Microarrays: Current Status, Existing Challenges and Future Outlook, Current Genomics, 9(7): 466–474, 2008.
  12. 12,0 12,1 12,2 12,3 12,4 12,5 Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 313.
  13. Richard C. Deonier, Simon Tavaré, Michael S. Waterman, 2005, Computational Genome Analysis: an Introduction, USA, Springer Science+Business Media, LLC, lk 300.
  14. R. J. Lipshutz, S. P. Fodor, T. R. Gingeras, D. J. Lockhart "High density synthetic oligonucleotide arrays", Nat. Genet. 21, 20–24, 1999.
  15. Fodor, S. P., et al. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science 251, 767–773, 1991.
  16. A.C. Pease, D. Solas, E.J. Sullivan, M.T. Cronin, C.P. Holmes, S.P. Fodor Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis, PNAS 91 (11): 5022–5026, 1994.
  17. 17,0 17,1 Richard C. Deonier, Simon Tavaré, Michael S. Waterman, 2005, Computational Genome Analysis: an Introduction, USA, Springer Science+Business Media, LLC, lk 299.
  18. Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 315
  19. Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 318
  20. Richard C. Deonier, Simon Tavaré, Michael S. Waterman, 2005, Computational Genome Analysis: an Introduction, USA, Springer Science+Business Media, LLC, lk 303.
  21. Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 368.
  22. Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 319.
  23. Jonathan Pevsner, 2009, Bioinformatics and Functional Genomics, second edition, USA, John Wiley & Sons, Inc., lk 320.