Mustand:Silmus-vahendatud isotermiline amplifikatsioon (LAMP)
Silmus-vahendatud isotermiline amplifikatsioon ( eng: Loop-mediated isothermal amplification ehk LAMP) on tehnoloogia DNA [1] võimendamiseks ning võimaldab odavama alternatiivse meetodi teatud haiguste tuvastamiseks. Pöördtranskriptsiooni silmuse vahendatud isotermiline võimendus (RT-LAMP) ühendab LAMP-i pöördtranskriptsiooni meetodiga, et võimaldada RNA tuvastamist.
LAMP on isotermiline nukleiinhapetest koosneva DNA lõikude kogu numbri võimendamise meetod. Vastupidiselt polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) tehnoloogiale, kus reaktsioon viiakse läbi etappilise temperatuuri reguleerimis tsüklitega, viiakse isotermiline võimendus läbi püsival temperatuuril ning seetõttu ei nõua temperatuuri täpset tsüklilist reguleerimist.
LAMP-i põhimõte[muuda | muuda lähteteksti]
LAMP-is võimendatakse sihtjärjestust konstantsel temperatuuril 60–65 ° C , kasutades kas kahte või kolme DNA fragmentide ehk praimerite komplekti ja polümeraasi, mis lisaks DNA ahela kopeerimisele võimaldab ka effektiivse liikumise mööda ahelat. Tavaliselt kasutatakse 4 erinevat praimerit sihtgeeni 6 erineva piirkonna võimendamiseks, mis suurendavad spetsiifilisust. Täiendav paar silmus-praimereid võib reaktsiooni veelgi kiirendada. [2] LAMP-tehnoloogiaga toodetud DNA kogus on tunduvalt suurem kui PCR- põhine amplifikatsioon.
Võimendatud väljund on mõõdetav kasutades fotomeetriat. Fotomeetrial põhinev reaktsiooni väljund on lihtne viis visuaalselt järgida tulemusi, kas otseselt vaadeldes või fotomeetrilisi mõõdikuid kasutades väiksemate koguste puhul. Reaktsiooni on võimalik järgida reaalajas kas hägususe põhjal [3] või fluorestseeruvate märgiste abil . Näiteks tekib DNA võimendamise järel ka magneesium fosfaadi ühendid mille kogust on võimalik mõõta lahuse hägususe muutuste põhjal. [4] Sageli kasutatav fluorestseeruvate märgis on näiteks roheline SYBR geen. Märgised seonduvad DNA ahelatega kovalentselt või molekulidevaheliste vastastikjõududega ning on seetõttu otseselt seotud algse DNA ahela kontsentratsiooniga võimaldades kvantitatiivse koguse määratlemise.
- ↑ "Loop-mediated isothermal amplification of DNA". Nucleic Acids Res. 28 (12): 63e–63. 2000. DOI:10.1093/nar/28.12.e63. PMC 102748. PMID 10871386.
- ↑ "Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers". Mol. Cell. Probes. 16 (3): 223–9. 2002. DOI:10.1006/mcpr.2002.0415. PMID 12144774.
- ↑ "Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA". J. Biochem. Biophys. Methods. 59 (2): 145–57. 2004. DOI:10.1016/j.jbbm.2003.12.005. PMID 15163526.
- ↑ "Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation". Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1): 150–4. 2001. DOI:10.1006/bbrc.2001.5921. PMID 11708792.