Reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon

Allikas: Vikipeedia
Jump to navigation Jump to search

Reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon ehk reaalaja PCR (RT-PCR) ehk kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (qPCR) on molekulaarbioloogia laborites kasutav meetod, mis põhineb polümeraasi ahelraktsioonil (PCR). Kui PCR-i puhul saab produkti analüüsida kõikide tsüklite lõpus, siis qPCR-i eeliseks on produkti kvantitatiivne mõõtmine iga tsükli järel. Reaalaja PCR-i kasutatakse paljudes valdkondades: meditsiinis haiguste diagnoosimisel, toidumikrobioloogias, teadustöödes. Teadustöödes kasutatakse eelkõige qPCR-i geeniekspresiooni uurimisel aga ka veel mikroRNA analüüsil, ühe nukleotiidi polümorfismi (SNP) genotüüpimisel, koopiaarvu variatsiooni (CNV) analüüsil ja ka valkude analüüsil.[1]

Taustinfo[muuda | muuda lähteteksti]

Rakud reguleerivad geeniekspressiooni RNA-dega või valkudega. Oluline on, kui palju mingit kindlat valku sünteesitakse. Et seda saaks mõõta, on vaja geeni transkripti paljundada. Üheks enamlevinud meetodiks DNA amplifitseerimiseks on polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR, RNA uurimiseks viiakse läbi pöördtranskriptsioon ning saadakse cDNA ehk komplementaarne DNA.[2]
DNA amplifitseerimiseks kasutatakse soovitud DNA lõiku šabloonina, disainitakse vastavale lõigule kaks praimerit (5'-3' ahelale ning 3'-5' ahelale), lisatakse desoksüribonukleotiide, mis on DNA ahela komponendid, lisatakse sobiv puhverlahus, mis loob sobiva keskkonna sünteesimiseks, ja termostabiilne DNA polümeraas (tööd tehakse teatud etappides kõrgetel temperatuuridel). Enamlevinuks polümeraasiks on Taq polümeraas. Lahusesse lisatakse ka fluorestseeruvat ainet, et hiljem oleks võimalik kindlal lainepikkusel mõõta produkti kogust. Kvantitatiivne PCR võimaldab kogust mõõta iga tsükli lõpus, kuid tavalise PCR puhul saame produkti kogust hinnata kogu protsessi lõpus. Siit tuleb ka qPCR-i üks nimetustest: reaalaja PCR. Juhul kui sünteesitakse cDNA pealt produkti, siis nimetatakse seda ka q-RT-PCR-iks (lühend ingliskeelsest väljendist quantitative-reverse transcription-polymerase chain reaction).[2]

*Lühend RT-PCR võib segadusse ajada, sest seda kasutatakse kahes tähenduses: revertaasi-transkriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon ja reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon.

qPCR töö[muuda | muuda lähteteksti]

qPCR iga tsükli võib jagada kolmeks etapiks ja ühe analüüsi korral läbitakse keskmiselt 40 tsüklit. Kolm peamist sammu on järgmised:[3]

  1. Denaturatsioon – inkubeeritakse kõrgel temperatuuril, et kaheahelaline ahel sulaks üheahelalisteks DNA-ks. Denaturatsiooni temperatuur ja aeg sõltub konkreetsest proovist. Kõrgeim temperatuur on tavaliselt 95 kraadi. Denaturatsiooni aega tuleks tõsta, kui DNA ahela GC protsent on kõrge.
  2. Annealing ehk praimerite seostumine – praimerid seonudvad DNA ahelale. Temperatuur sõltub praimerite sulamistemperatuurist.
  3. DNA süntees – DNA-d hakkatakse sünteesima praimeritega seondunud alalt. Vastavalt komplementaarsele ahelale hakkab DNA polümeraas sünteesima uut ahelat. DNA polümeraasi aktiivsus on optimaalne 70–72 kraadi juures, sünteesi kiirus on keskmiselt 100 aluspaari sekundis.

qPCR produktide tuvastamine reaalajas toimub fluorestsentsi abil. Ühe meetodi puhul kasutatakse mittespetsiifilist fluorestseeruvat värvi (näiteks SYBR Green), mis seondub DNA ahelate vahele – mida rohkem dsDNA-d on lahuses, seda rohkem värvi saab sellega seonduda ning seda tugevam on signaal. Teise meetodi puhul toimub ahelale seondumine spetsiifiliselt (näiteks Taqman proov). DNA lõigu ühes otsas on märgis ja teises otsas on ühend quencher, mis ei lase signaalil avalduda. Kui see DNA lõik aga ahelasse seondatakse, siis reaktsiooni käigus fluorestseeruv märgis vabaneb ja annab signaali.[4]

Mõisted[muuda | muuda lähteteksti]

Threshold ehk läviväärtus.[2]

Reaalaja PCR andmeanalüüsiks vajalikud põhimõisted:[5]
algtase (baseline) – näitab signaali taset esimeste tsüklite ajal (enamasti kuni 15 tsüklit), näitab vähest fluorestseeruvat signaali. Algtaset määratakse ka kui taustamüra;
läviväärtus (threshold) – signaalitase, mis peegeldab statistiliselt suurt tõusu võrreldes algtasemega, kuid peab jääma PCR-i eksponentsiaalsesse faasi. Määratakse lävitsükkel (CT);
lävitsükkel (threshold cycle ehk CT) – CT on tsüklite arv, millal reaktsiooni fluorestseeruv signaal ületab läviväärtuse. CT oleneb ka DNA kogusest;

sulamiskurv – peegeldab fluorestseeruva signaali muutust, kui kaheahelaline DNA koos värvimolekulidega dissotseerub üheahelaliseks DNA-ks (sulamine toimub temperatuuri tõusu tagajärjel). Kui võrrelda fluorestseeruvat signaali muutust temperatuuri muutusega, siis saame selge pildi sulamise dünaamikast[6]. Samuti annab see meile infot, kas tegu on ühe produktiga või on proov saastunud.

Kasutusvaldkonnad[muuda | muuda lähteteksti]

Geeniekspresiooni analüüs[muuda | muuda lähteteksti]

Geeniekspressiooni analüüsi all peetakse silmas, kui palju geenidelt transkribeeritakse funktsionaalseid produkte – RNA-sid või valke. Geeniekspressioonil on kolm olulist etappi:[7]

  1. transkriptsioon ehk DNA pealt RNA süntees
  2. splaissimine ehk intronite eemaldamine ning eksonite ühendamine
  3. translatsioon ehk valgu süntees

Geeniekspresiooni või mRNA (messenger RNA) analüüsiks kasutatakse tihti just qPCR. Tehakse pöördtrankriptsioon (RNA pealt sünteesitakse cDNA). cDNA pealt tuvastatakse ja mõõdetakse ekspresseeritud geeni produkt[1].

Lisaks kvantitatiivsele PCR-ile kasutatakse geeniekspressiooni uurimiseks DNA-mikrokiiptehnoloogiat. Vanemate meetoditega mõõdeti just mRNA hulga ning sellekas kasutati: Northern blottingut, ribonukleaas (RNaas) testi ja Differential display-d.[2]

MikroRNA analüüs[muuda | muuda lähteteksti]

MikroRNA analüüsiks tuleb RNA isoleerida, profileerida (RNA tüüpimine), paljundada ja see kinnitada.

MiRNA-d on väikesed, väga konserveerunud RNA molekulid, mis reguleerivad raku arengut, raku tsüklit ning takistavad rakkude kontrollimatut paljunemist. Aktiivne miRNA on üheahelaline molekul, keskmiselt 17–24 nukleotiidi pikk. Arvatakse, et rohkem kui kolmandik geenidest on reguleeritud miRNA-de poolt.[8]

Geeni variatsiooni analüüs[muuda | muuda lähteteksti]

Reaalaja PCR seadmeid ja metoodikat kasutatakse ka geeni variatsiooni analüüsideks. Need tehnikad pole kvantitatiivseteks mõõtmisteks ja genotüüpimiseks kasutatakse alleeli-spetsiifilisi proovide-komplekte. Andmed kogutakse pärast kõikide tsüklite lõppu.[1]

Teadlased, kes uurivad geenide funktsioone, peavad arvestame geenide variatsioonidega. Geenide variandid võivad olla looduses mitmekesised, alates ühest nukleotiidi variandist, tandeemsetest järjestustest, väiksematest insertsioonidest või deletsioonidest kuni suurte koopiaarvude variantideni. Varem oli vähe informatsiooni geneetilisest variatsioonist, kuid nüüd tänu meetodite arengule on infot palju.[9]

Reaalaja PCR-is kasutatavad masinad[muuda | muuda lähteteksti]

Reaalaja PCR läbiviimiseks on mitmeid seadmeid. Igal aparaadil peab olema

  1. sensor, mis tuvastab fluorestseeruvat värvi ja signaali;
  2. termotsükkel, kuna temperatuure tuleb kiiresti iga etapi jooksul muuta.

Kõikidel masinatel on kaasas ka tarkvara andmete kogumiseks ja analüüsimiseks.[10]

Viited[muuda | muuda lähteteksti]

  1. 1,0 1,1 1,2 https://www.thermofisher.com/ee/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/what-can-you-do-with-qpcr.html, thermo fisher scientific What Can You Do with Real-Time PCR (qPCR)?, 21.11.2017
  2. 2,0 2,1 2,2 2,3 https://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction, 21.11.2017
  3. Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 3
  4. Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 10–11
  5. Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 6
  6. Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 8
  7. https://et.wikipedia.org/wiki/Geeniekspressioon, 21.11.2017
  8. https://www.thermofisher.com/ee/en/home/references/ambion-tech-support/microrna-studies/tech-notes/microrna-analysis.html – MicroRNA Analysis, Thermo Fisher Scientific, 21.11.2017
  9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20238073, Genetic variation analysis for biomedical researchers: a primer, Medicines Research Centre, GlaxoSmithKline Research & Development Limited, Stevenage, Hertfordshire, UK.,21.11.2017
  10. Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 13