Kõrgsurvevedelikkromatograafia

Allikas: Vikipeedia
(Ümber suunatud leheküljelt Kõrgsurve-vedelikkromatograafia)
HPLC aparatuuri ehitus skemaatiliselt, kus 1 – pudelid eluentidega, 2 – eluendi degasaator, 3 – gradientkraan, 4 – eluendi sisestamise nõu, 5 – kõrgsurvepump, 6 – kraan sisestamise asendis, 6’ – kraani laadimisasend, 7 – silmus, 8 – eelkolonn, 9 – kromatograafiline kolonn, 10 – detektor, 11 – andmete töötlemise seade, 12 – jääkide või fraktsiooni koguja.

Kõrgsurvevedelikkromatograafia (high-pressure liquid chromatography, HPLC) on kromatograafiline tehnika, mille korral kasutatakse liikuva faasina vedelikke (eluent) ja statsionaarse faasina väga peeneteralisi (suurusjärgus 5μm) kromatograafilise kolonni täidiseid. Nimetatakse seda meetodit ka kõrgefektiivne vedelikukromatograafia (high-performance liquid chromatography, HPLC). Peeneteralise täidise suure takistuse tõttu tuleb proovi eluendiga kolonnist läbivoolutamiseks kasutada survepumpa, et saavutada piisav vedeliku rõhk (kuni 400 at). Välja on arendatud HPLC spetsiifilised aparatuursed lahendused.

Võrdluseks: Olulise lisasurveta kromatograafia korral kasutatakse mõistet "kolonnkromatograafia". Siin ainete segu lahutatakse täidiskolonnis kusjuures tavaliselt eluent liigub kolonnist läbi vedelikusamba raskuksjõu mõjul.

Täidiskolonnide korral on selle parameetritel oluline tähtsus kolonni lahutusvõimele: pikema ja peenema täidisega kolonni lahutusvõime on palju suurem, kuid, teiseltpoolt, nõuab see vedeliku täidisest läbisurumiseks (suurt) rõhku. Selleks on välja töötatud efektiivsemad (kiiremad) surve-vedelikukromatograafia meetodid.

Kõrgsurvekromatograafiat kasutatakse biokeemias ja analüütilises keemias uuritava segu komponentide identifitseerimiseks või komponentide suhtelise sisalduse määramiseks (kolonni sisediameeter tavaliselt 4,6 mm) või mingi komponendi puhastamiseks ja kogumiseks (kolonni sisediameeter üle 10 mm).

Kõrgsurve vedelikukromatograafias kasutatakse erinevat tüüpi statsionaarse faasiga täidetud kolonne, millest sõltub ainete lahutamise mehhanism ja vastavalt sellele eristatakse rida meetodeid. HPLC – kui üldise aparatuurse tehnika – enamtuntud meetodid (ja meetodite modifikatsioonid) on järgmised:

Kõrgsurve-vedelikkromatograafia aparatuur[muuda | muuda lähteteksti]

Kõrgsurve-vedelikkromatograafia aparatuur koosneb viiest põhilisest komponendist: pump, proovisisestussüsteem, kolonn, detektor ning juhtarvuti.

Pump[muuda | muuda lähteteksti]

Pumba eesmärgiks on suruda mobiilne faas läbi kromatograafi kindlal voolukiirusel. HPLC puhul on tavalisteks voolukiirusteks 1–2 milliliitrit/minutis (mL/min). Tavalisemad pumbad töötavad rõhuvahemikus 400–600 baari. Pumbad võimaldavad teha nii isokraatilist (eluendi komponentide osakaalu ajas ei muudeta) kui gradientelueerimist (eluendi komponentide osakaalu muudetakse ajas). Isokraatilise pumba puhul peavad solvendid ehk lahustid olema eelnevalt segatud ning see on kõige odavam pump. Gradientpump suudab ise solvente segada, aga samas saab teha ka isokraatilist elueerimist.

Proovisisestussüsteem[muuda | muuda lähteteksti]

Proov süstitakse mobiilsesse faasi. Tüüpilisemad süsti ruumalad on 4–20 mikroliitrit (uL). Proovisisestus süsteem ehk injector peab vastu pidama kõrgele survele. Automaatse proovisisestuse ehk autosampleri kasutamine on hädavajalik, kui on vaja analüüsida kümneid või sadu proove järjest.[1]

Kolonn[muuda | muuda lähteteksti]

Kolonn ja selle omadused on kõige suurem erinevus normaalfaaskromatograafia ja pöördfaaskromatokraafia vahel. Kolonni kutsutakse ka „kromatograafi südameks“[2] ning see eraldab proovi komponendid. Kolonni täidisosakesed (mis normaalfaasi puhul on polaarsed ja pöördfaasi puhul on mittepolaarsed) põhjustavad normaalsetel voolukiirustel vastusurvet. Pump peab mobiilset faasi suruma läbi kolonni ja see tekitab kolonnis kõrget survet. Kolonnid valmistatakse enamasti terasest, sisediameetriga 2–4,6 mm. Pikkus enamasti 10–30 cm. [2][1]

Detektor[muuda | muuda lähteteksti]

Detektor tuvastab molekulid ja nende hulga, mis kolonnist väljuvad, ning selle järgi saab teostada kvantitatiivset analüüsi.

Arvuti/andmehõivesüsteem[muuda | muuda lähteteksti]

Kontrollib HPLC süsteemi kõiki osasid. Arvuti võimaldab detektori signaali abil kindlaks teha proovi kõikide komponentide (kvalitatiivne analüüs) retentsiooniaja ning koguse (kvantitatiivne analüüs).[1]

Viited[muuda | muuda lähteteksti]

  1. 1,0 1,1 1,2 Agilent Technologies, | HPLC Basics, Fundamentals of Liquid Chromatography (HPLC). Viimati vaadatud 29.09.2014
  2. 2,0 2,1 L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glaych, "Practical HPLC Method Development"(1997), 2nd ed., ISBN 978-0-471-00703-6

Vaata ka[muuda | muuda lähteteksti]