Kõrgsurvevedelikkromatograafia

HPLC aparatuuri ehitus skemaatiliselt, kus 1 – pudelid eluentidega, 2 – eluendi degasaator, 3 – gradientkraan, 4 – eluendi sisestamise nõu, 5 – kõrgsurvepump, 6 – kraan sisestamise asendis, 6’ – kraani laadimisasend, 7 – silmus, 8 – eelkolonn, 9 – kromatograafiline kolonn, 10 – detektor, 11 – arvuti, 12 – jääkide või fraktsiooni koguja.

Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia ehk kõrgsurvevedelikkromatograafia (high-performance liquid chromatography, HPLC) on kromatograafiline meetod, kus kasutatakse statsionaarse faasina kromatograafilise kolonni tahket peeneteralist täidist ning liikuva faasina vedelikku ehk eluenti. Peeneteraline täidis põhjustab suurt takistust ning seetõttu kasutatakse eluendi kolonnist läbivoolutamiseks kõrgsurvepumpa.

Üks kõrgefektiivse vedelikkromatograafi tähtsamaid parameetreid on kolonni lahutusvõime. Mida pikem on kolonn ja peeneteralisem selle täidis, seda suurem on kolonni lahutusvõime, kuid seda kõrgem peab olema ka eluendile avaldatav surve. Tavalises kõrgefektiivses vedelikkromatograafias kasutatakse umbes 250-300 baari suurust rõhku ning täidise terade suurus jääb vahemikku 3-5 μm. Uuemad kõrgsurvevedelikkromatograafid (nimetatakse ka ultra-performance liquid chromatography, UPLC) võimaldavad lahutada komponente veelgi efektiivsemalt, kasutades väga peenete teradega täidiseid (1-2 μm) ja kõrgemat survet (kuni 1000 baari). Mõlemat tüüpi seadmeid kasutatakse selleks, et uurida nii kvantitatiivselt kui ka kvalitatiivselt segu koostisosasid (kromatograafiline analüüs), ning nende kolonni sisediameeter on umbes 4,6 mm (UPLC puhul väiksem).

Kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat kasutatakse ka uuritava ühendi lahutamiseks teistest segu koostisosadest, et ühendit teatud hulgal koguda (preparatiivne kromatograafia). Sellisel juhul on täidise terad suuremad (üle 10 μm) ning kolonnide läbimõõt vähemalt kaks korda suurem (sisediameeter üle 10 mm).

Olenevalt kasutatavast statsionaarse faasi või liikuva faasi tüübist lahutatakse ained erineval viisil ja vastavalt sellele eristatakse järgmisi meetodeid (ja meetodite modifikatsioone):

• Normaalfaasiline kõrgsurvevedelikkromatograafia, kus polaarne statsionaarne faas on silikageel ja liikuv faas on mittepolaarne. Selle meetodi üks modifikatsioone on hüdrofiilne interaktsioonikromatograafia (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC), kus polaarse statsionaarse faasi külge on seotud hüdrofiilsed diool-, amiino- või amiidrühmad ning liikuv faas sisaldab väikeses koguses vett.
• Pöördfaasiline kõrgsurvevedelikkromatograafia (reversed-phase HPLC, RP-HPLC), kus mittepolaarne statsionaarne faas on silikageel, mille külge on keemiliselt seotud alküülrühmad, ning liikuv faas on polaarne. Pöördfaasilise HPLC üks modifikatsioone on mitselle sisaldava vesilahuse kasutamine liikuva faasina (micellar liquid chromatography, MLC).
• Ioonivahetuskromatograafias on statsionaarne faas tahke polüelektrolüüt (ioniit), mille ioonsed funktsionaalrühmad interakteeruvad proovis olevate vastasmärgilise laenguga ioonidega. Seotud ioonid elueeritakse, muutes liikuva faasi soolasisaldust või pH-d.
• Suurus-eraldus-kromatograafias (size-exclusion chromatography, SEC) kasutatakse statsionaarse faasina poorset geeli, millest lahuses olevad molekulid väljuvad vastavalt suurusele. Eristatakse geelfiltratsioonkromatograafiat, milles kasutatakse läbivoolutamiseks vesilahust ja geelkromatograafiat (GPC), milles liikuv faas on orgaaniline lahusti.
• Afiinsuskromatograafial põhinev HPLC (high-performance liquid affinity chromatography, HPLAC) on meetod, milles eraldatavad ained seonduvad esmalt kolonni täidisega seotud ligandiga ning elueeritakse seejärel kolonnist.
• Kiraalne kõrgsurvevedelikkromatograafia, kus kasutatakse enantiomeeride lahutamiseks kiraalset liikuvat või liikumatut faasi.
• Ultraefektiivne vedelikkromatograafia (ultra-performance liquid chromatography, UPLC), kus tänu väga peenetele teradele ja kolonni väiksemale läbimõõdule on võimalik lahutada ka ainesegusid, milles on väga palju eri ühendeid.

Kõrgsurvevedelikkromatograafia aparatuur

Kõrgsurvevedelikkromatograafia aparatuur koosneb viiest põhilisest komponendist: pump, sisesti, kolonn, detektor ning arvuti.

Pump

Pumba eesmärk on liikuv faas kindlal voolukiirusel läbi kromatograafi suruda. Keskmine voolukiirus HPLC süsteemis on 1–2 ml/min. Tavaliselt kasutatakse pumpasid, mis võimaldavad avaldada hüdraulilist rõhku kuni 600 baari. Pumbad võimaldavad teha nii isokraatilist elueerimist (liikuva faasi koostis analüüsi käigus ei muutu) kui ka gradientelueerimist (liikuva faasi koostis muutub analüüsi käigus). Isokraatiline pump on kõige soodsam, kuid teda kasutades peavad lahustid olema eelnevalt segatud. Gradientpumbad on kallimad, kuid tänu nende omadusele ise lahusteid segada, saab neid kasutada ka gradientelueerimiseks.

Sisesti

Sisesti ehk injektor peab vastu pidama kõrgele survele. Väike kogus (tavaliselt 3-100 µl) proovi süstitakse süstlaga läbi spetsiaalse vaheseina või silmuse liikuvasse faasi. Kui on vaja analüüsida suurt hulka proove, siis on asendamatu automaatsisesti (autosampler), mille abil on võimalik analüüsida üksteise järel kuni mitusada proovi.

Kolonn

Kolonn on kromatograafias väga oluline komponent, sest temas lahutuvad proovi koostisosad. HPLC kolonnid on väikese läbimõõduga ning täidetud peenetest teradest koosneva maatriksiga. Et nendest omadustest tulenevat takistust ületada, peab liikuvat faasi kõrgsurvepumba abil läbi kolonni suruma. Kolonnid valmistatakse enamasti roostevabast terasest, sisediameetriga 1–10 mm ja pikkusega 30–300 mm.

Detektor

Detektor tuvastab molekulid, mis kolonnist väljuvad, ja nende hulga, ning see võimaldab neid analüüsida nii kvantitatiivselt kui ka kvalitatiivselt.

Arvuti

Arvuti kontrollib HPLC süsteemi kõiki osasid ning võimaldab detektori signaali abil kindlaks teha proovi kõikide komponentide retentsiooniaja (kvalitatiivne analüüs) ning koguse (kvantitatiivne analüüs).

Vaata ka

• Jaotuskromatograafia
• Kolonnkromatograafia
• Pöördfaaskromatograafia
• Kromatograafia
• Vedelikkromatograafia-massispektromeetria