Kõrgsurvevedelikkromatograafia: erinevus redaktsioonide vahel
Resümee puudub |
Resümee puudub |
||
6. rida: | 6. rida: | ||
Üks kõrgefektiivse vedelikkromatograafi tähtsamaid parameetreid on kolonni [[lahutusvõime]]. Mida pikem on kolonn ja peeneteralisem selle täidis, seda suurem on kolonni lahutusvõime, kuid seda kõrgem peab olema ka eluendile avaldatav surve. Tavalises kõrgefektiivses vedelikkromatograafias kasutatakse umbes 250-300 baari suurust rõhku ning täidise terade suurus jääb vahemikku 3-5 μm. Uuemad kõrgsurvevedelikkromatograafid (nimetatakse ka ''ultra-performance liquid chromatography'', UPLC) võimaldavad lahutada komponente veelgi efektiivsemalt, kasutades väga peenete teradega täidiseid (1-2 μm) ja kõrgemat survet (kuni 1000 baari). Mõlemat tüüpi seadmeid kasutatakse selleks, et uurida nii kvantitatiivselt kui ka kvalitatiivselt segu koostisosasid ([[kromatograafiline analüüs]]), ning nende kolonni sisediameeter on umbes 4,6 mm (UPLC puhul väiksem). |
Üks kõrgefektiivse vedelikkromatograafi tähtsamaid parameetreid on kolonni [[lahutusvõime]]. Mida pikem on kolonn ja peeneteralisem selle täidis, seda suurem on kolonni lahutusvõime, kuid seda kõrgem peab olema ka eluendile avaldatav surve. Tavalises kõrgefektiivses vedelikkromatograafias kasutatakse umbes 250-300 baari suurust rõhku ning täidise terade suurus jääb vahemikku 3-5 μm. Uuemad kõrgsurvevedelikkromatograafid (nimetatakse ka ''ultra-performance liquid chromatography'', UPLC) võimaldavad lahutada komponente veelgi efektiivsemalt, kasutades väga peenete teradega täidiseid (1-2 μm) ja kõrgemat survet (kuni 1000 baari). Mõlemat tüüpi seadmeid kasutatakse selleks, et uurida nii kvantitatiivselt kui ka kvalitatiivselt segu koostisosasid ([[kromatograafiline analüüs]]), ning nende kolonni sisediameeter on umbes 4,6 mm (UPLC puhul väiksem). |
||
Kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat kasutatakse ka |
Kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat kasutatakse ka uuritava ühendi lahutamiseks teistest segu koostisosadest, et ühendit suuremal hulgal koguda ([[preparatiivne kromatograafia]]). Sellisel juhul on täidise terad suuremad (üle 10 μm) ning kolonnide läbimõõt vähemalt kaks korda suurem (sisediameeter üle 10 mm). |
||
Kõrgsurve vedelikukromatograafias kasutatakse erinevat tüüpi [[statsionaarne faas|statsionaarse faasiga]] täidetud kolonne, millest sõltub ainete lahutamise mehhanism ja vastavalt sellele eristatakse rida meetodeid. HPLC – kui üldise aparatuurse tehnika – enamtuntud meetodid (ja meetodite modifikatsioonid) on järgmised: |
Kõrgsurve vedelikukromatograafias kasutatakse erinevat tüüpi [[statsionaarne faas|statsionaarse faasiga]] täidetud kolonne, millest sõltub ainete lahutamise mehhanism ja vastavalt sellele eristatakse rida meetodeid. HPLC – kui üldise aparatuurse tehnika – enamtuntud meetodid (ja meetodite modifikatsioonid) on järgmised: |
Redaktsioon: 5. jaanuar 2018, kell 17:08
See artikkel ootab keeletoimetamist. |
Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia ehk kõrgsurvevedelikkromatograafia (high-performance liquid chromatography, HPLC) on kromatograafiline meetod, kus kasutatakse statsionaarse faasina kromatograafilise kolonni tahket peeneteralist täidist ning liikuva faasina vedelikku ehk eluenti. Peeneteraline täidis põhjustab suurt takistust ning seetõttu kasutatakse eluendi kolonnist läbivoolutamiseks kõrgsurvepumpa.
Üks kõrgefektiivse vedelikkromatograafi tähtsamaid parameetreid on kolonni lahutusvõime. Mida pikem on kolonn ja peeneteralisem selle täidis, seda suurem on kolonni lahutusvõime, kuid seda kõrgem peab olema ka eluendile avaldatav surve. Tavalises kõrgefektiivses vedelikkromatograafias kasutatakse umbes 250-300 baari suurust rõhku ning täidise terade suurus jääb vahemikku 3-5 μm. Uuemad kõrgsurvevedelikkromatograafid (nimetatakse ka ultra-performance liquid chromatography, UPLC) võimaldavad lahutada komponente veelgi efektiivsemalt, kasutades väga peenete teradega täidiseid (1-2 μm) ja kõrgemat survet (kuni 1000 baari). Mõlemat tüüpi seadmeid kasutatakse selleks, et uurida nii kvantitatiivselt kui ka kvalitatiivselt segu koostisosasid (kromatograafiline analüüs), ning nende kolonni sisediameeter on umbes 4,6 mm (UPLC puhul väiksem).
Kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat kasutatakse ka uuritava ühendi lahutamiseks teistest segu koostisosadest, et ühendit suuremal hulgal koguda (preparatiivne kromatograafia). Sellisel juhul on täidise terad suuremad (üle 10 μm) ning kolonnide läbimõõt vähemalt kaks korda suurem (sisediameeter üle 10 mm).
Kõrgsurve vedelikukromatograafias kasutatakse erinevat tüüpi statsionaarse faasiga täidetud kolonne, millest sõltub ainete lahutamise mehhanism ja vastavalt sellele eristatakse rida meetodeid. HPLC – kui üldise aparatuurse tehnika – enamtuntud meetodid (ja meetodite modifikatsioonid) on järgmised:
- vedelik-vedelikukromatograafia korral ainete segu lahutumine põhineb komponentide kahe erineva mitteseguneva vedelfaasi (üks liikuv teine statsionaarne faas) vahel jaotumise erinevustel; kõige enam kasutatav on kõrgefektiivne vedelikukromatograafia, mille puhul eristatakse mitmeid edasiarendusi ja modifikatsioone nagu:
- normaalfaasi vedelikukromatograafia (NPLC, kus statsionaarne faas on polaarne ja liikuv faas on mittepolaarne);
- Pöördfaaskromatograafia (pööratud faasi kromatograafia) (RPLC või RP-HPLC, see on vedelikukromatograafia modifikatsioon, milles liikuv faas on oluliselt polaarsem kui liikumatu faas);
- hüdrofiilne interaktsioonikromatograafia (HILIC, see on vedelikukromatograafia modifikatsioon, milles tüüpiline liikuv faas on atsetonitriil (MeCN) väikese vee lisandiga ja siin analüüdid väljuvad polaarsuse suurenemise järjestuses);
- mitsellaarne vedelikukromatograafia (MLC, kus liikuv faas on pindaktiivset ainet sisaldav vesilahus);
- ultrakõrgsurve ehk ultraefektiivne vedelikukromatograafia (U-HPLC ehk UPLC, kus kasutatakse ekstra peeneteralist täidist);
- kiraalne kromatograafia (see on meetod enantiomeeride lahutamiseks kasutades kiraalset liikuvat või kiraalset liikumatut faasi)
- vedelikukromatograafia süsteemid proteiinide puhastamiseks
- ioonivahetuskromatograafias toimub ioonide lahutamine tahkel polüelektrolüüdil (ioniidil), toimuvad ioonivahetusreaktsioonid lahustunud proovi ja ioniidi vahel
- eksklusioonkromatograafia (SEC ehk HPSEC) (geelfiltratsioon, geelkromatograafia (GPC), molekulaarsõel kromatograafia) puhul segu läbivoolutamisel poorsest polümeersest materjalist või geelist või molekulaarsõeltest molekulid väljuvad kolonnist sõltuvalt nende suurusest
- afiinsuskromatograafia on meetod bioproovide lahutamiseks spetsiifilise interaktsiooni läbi
Kõrgsurve-vedelikkromatograafia aparatuur
Kõrgsurve-vedelikkromatograafia aparatuur koosneb viiest põhilisest komponendist: pump, proovisisestussüsteem, kolonn, detektor ning juhtarvuti.
Pump
Pumba eesmärgiks on suruda mobiilne faas läbi kromatograafi kindlal voolukiirusel. HPLC puhul on tavalisteks voolukiirusteks 1–2 milliliitrit/minutis (mL/min). Tavalisemad pumbad töötavad rõhuvahemikus 400–600 baari. Pumbad võimaldavad teha nii isokraatilist (eluendi komponentide osakaalu ajas ei muudeta) kui gradientelueerimist (eluendi komponentide osakaalu muudetakse ajas). Isokraatilise pumba puhul peavad solvendid ehk lahustid olema eelnevalt segatud ning see on kõige odavam pump. Gradientpump suudab ise solvente segada, aga samas saab teha ka isokraatilist elueerimist.
Proovisisestussüsteem
Proov süstitakse mobiilsesse faasi. Tüüpilisemad süsti ruumalad on 4–20 mikroliitrit (uL). Proovisisestus süsteem ehk injector peab vastu pidama kõrgele survele. Automaatse proovisisestuse ehk autosampleri kasutamine on hädavajalik, kui on vaja analüüsida kümneid või sadu proove järjest.[1]
Kolonn
Kolonn ja selle omadused on kõige suurem erinevus normaalfaaskromatograafia ja pöördfaaskromatokraafia vahel. Kolonni kutsutakse ka „kromatograafi südameks“[2] ning see eraldab proovi komponendid. Kolonni täidisosakesed (mis normaalfaasi puhul on polaarsed ja pöördfaasi puhul on mittepolaarsed) põhjustavad normaalsetel voolukiirustel vastusurvet. Pump peab mobiilset faasi suruma läbi kolonni ja see tekitab kolonnis kõrget survet. Kolonnid valmistatakse enamasti terasest, sisediameetriga 2–4,6 mm. Pikkus enamasti 10–30 cm. [2][1]
Detektor
Detektor tuvastab molekulid ja nende hulga, mis kolonnist väljuvad, ning selle järgi saab teostada kvantitatiivset analüüsi.
Arvuti/andmehõivesüsteem
Kontrollib HPLC süsteemi kõiki osasid. Arvuti võimaldab detektori signaali abil kindlaks teha proovi kõikide komponentide (kvalitatiivne analüüs) retentsiooniaja ning koguse (kvantitatiivne analüüs).[1]
Viited
- ↑ 1,0 1,1 1,2 Agilent Technologies, | HPLC Basics, Fundamentals of Liquid Chromatography (HPLC). Viimati vaadatud 29.09.2014
- ↑ 2,0 2,1 L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glaych, "Practical HPLC Method Development"(1997), 2nd ed., ISBN 978-0-471-00703-6
Vaata ka
Pildid, videod ja helifailid Commonsis: Kõrgsurve vedelikukromatograafia |