Transformatsioon (geneetika): erinevus redaktsioonide vahel

Allikas: Vikipeedia
Eemaldatud sisu Lisatud sisu
Helgasch (arutelu | kaastöö)
Helgasch (arutelu | kaastöö)
69. rida: 69. rida:
Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal kylmas CaCl<sub>2</sub> lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42°C juures sõltuvalt metoodikast 30-120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks
Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal kylmas CaCl<sub>2</sub> lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42°C juures sõltuvalt metoodikast 30-120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks
keskmiselt 10<sup>6</sup> - 10<sup>7</sup> transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.
keskmiselt 10<sup>6</sup> - 10<sup>7</sup> transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.

Transformatsiooni efektiivsus väheneb plasmiidi suuruse kasvades, mistõttu kasutatakse suuremate plasmiidide ja kosmiidide puhul elektroporatsiooni. Elektroporeeritavaid rakke on enne töötlust soovitatav pesta kylma mitmekordselt destilleeritud veega, eemaldamaks laetud osakesi, mis protsessi käigus sädet anda võiksid.


<references/>
<references/>

Redaktsioon: 4. november 2011, kell 04:13

Molekulaarbioloogias mõistetakse transformatsiooni all raku geneetilist muutumist, mis johtub vaba, valkude poolt sidumata eksogeense DNA sattumisest väliskeskkonnast läbi rakumembraani rakku, kus see raku enda geneetilise materjaliga liidetakse ning võõrgeeni ekspresseeritakse. Transformatsiooni tuleb ette nii mõnede bakteriliikide puhul looduses kui ka sihipärase tegutsemise tulemusena laboris. Transformatsioon on yks kolmest protsessist, mille käigus on võimalik võõr-DNA-d bakterirakku viia. Teisteks võimalusteks on konjugatsioon, mis ilmneb kahe bakteri otsesel kokkupuutel, ja transduktsioon, kus eksogeenne materjal viiakse bakterirakku bakteriofaagi abil. Baktereid, kes on võimelised transformeeruma, nimetatakse kompetentideks. Ka teisi rakke peale bakterite on võimalik transformeerida, näiteks taime- ja loomarakke, kuid eelistatum mõiste kirjeldamaks võõr-DNA viimist eukaryootsesse rakku on transfektisoon. Loomarakkude puhul välditakse antud protsessi puhul transformatsiooni mõiste kasutamist, sest "malignant transformation" ehk pahaloomuline transformatsioon tähendab yhtlasi ka normaalsete rakkude muutumist pahaloomulisteks kasvajarakkudeks, mil pole midagi pistmist rakuvälise geneetilise materjali sattumisega rakku.


Ajalugu

Esmakordselt demonstreeris transformatsiooni toimumist aastal 1928 briti bakterioloog Frederick Griffith, kes tegeles kahe Streptococcus pneumoniae tyve uurimisega. Kui Griffith systis hiiri ohutu tyve (II-R) bakterite või kuumusega tapetud haigust tekitava tyve (III-S) bakteritega, jäid hiired ellu, kuid nende kahe kombinatsioon osutus hiirtele surmavaks. Surnud hiirte verest õnnestus tal isoleerida mõlema tyve elusaid rakke ning järeldas sellest, et mingi seaduspära järgi on võimalik yhe bakterityve muundumine teiseks. Tema mõtet arendasid edasi Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty, kes tõestasid aastal 1944, et tegu on geneetilise materjali ylekandega. Kasutades samu tyvesid, isoleerisid nad virulentse tyve DNA ja näitasid, et selle viimisest II-R tyvesse piisab, et kahjutu tyvi samuti virulentseks muutuks, kummutades sellega tol ajal laialt levinud arusaama, et valgud on pärilikkust kandvaks materjaliks. DNA hõivamist väliskeskkonnast rakku ja selle arvamist raku enese DNA hulka hakkasid nad nimetama transformatsiooniks. Algul suhtuti nende avastusse kyll suure umbusuga, kuid geneetiliste markerite kasutuselevõtt ja teiste geneetilise materjali ylekandemeetodite avastamine Joshua Lederbergi poolt (konjugatsioon 1947. ja transduktsioon 1953. aastal) veenis teaduskogukonda Avery tulemusi tunnustama.

Siiski oldi ysna veendunud, et Escherichia coli ei ole transformatsioonialdis. Alles aastal 1970 näitasid Morton Mandel ja Akiko Higa, et kaltsiumkloriidi lahusega töötlemise tagajärjel on E. coli võimeline väliskeskkonnast ilma faagi abita bakteriofaagi DNA-d inkorporeerima. Paar aastat hiljem tõestasid Stanley Cohen, Annie Chang ja Leslie Hsu, et sarnane meetod on efektiivne ka plasmiidse DNA puhul. Mandeli ja Higa meetodit arendas hiljem edasi Douglas Hanahan. Kunstlikult tekitatud kompetentsuse võimalikkus E. coli kui laialdaselt kasutatava mudelorganismi puhul pani aluse mugava ja efektiivse metoodika arendamisele bakterite transformeerimiseks, mis võimaldab biotehnoloogias ja teadustöös kasutada varasemast oluliselt lihtsamaid molekulaarse kloneerimise võtteid. Praeguseks on transformatsiooni näol tegu igapäevase laboriprotseduuriga.

Transformatsioon elektroporatsiooni teel arendati välja 1980 aastate lõpul, tuues kaasa in-vitro transformatsiooni efektiivsuse tõusu ja võimaluse enamate bakterityvede transformatsiooniks. Uuriti ka taime- ja loomarakkude transformeerimise võimalusi, mis päädis esimese transgeense hiire loomisega aastal 1982, systides hiire embryosse geeni roti kasvuhormooni jaoks. Varajastel 70-dail avastati, et Ti-plasmiid Agrobacterium tumefaciensi rakkudes on põhjuseks, miks antud bakter taimedele kasvajaid tekitab. Ti-plasmiid integreerub taime genoomi, kutsudes esile tuumorite teket. Asendades Ti-plasmiidis kasvajat tekitava geeni mõne muu huvipakkuva geeniga on võimalik A. tumefaciensiga taimi nakatades kaheiduleheliste taimede genoomi viia valitud DNA. Yheiduleheliste ja mõningate teiste A. tumefaciensi suhtes tundetute taimede transformatsiooniks kasutatakse elektroporeerimist ning mikro-injektsiooni. Biolistilise meetodi ehk raku pommitamise geneetilise materjaliga kaetud metalliioonidega võttis 1990 aastal kasutusele John Stanford.


Mehhanismid

Bakterid

Bakterite puhul mõistetakse transformatstiooni all pysivat muutust, mida on toonud kaasa vaba DNA hõivamine väliskeskkonnast rakku ja kompetentsuse all peetakse silmas võimet vaba DNA-d rakuvällisest keskkonnast rakku võtta. Kompetentsus võib olla nii loomulik kui kunstlik.

Looduslik kompetentsus

Umbes 1% bakteriliikidest on loomulikult kompetentsed, olles võimelised laborikeskkonnas ilma lisatöötluseta vaba DNA-d oma rakku võtma. On alust arvata, et looduslikus keskkonnas on see protsent suurem. Kui DNA kandub yle yhelt bakterityvelt teisele, nimetatakse seda horisontaalseks geeniylekandeks, mis on geneetilise materjali saamine teiselt organismilt, olemata selle järglane. [1] Lähedaste liikide vahel toimib transformatsioon paremini kui evolutsiooniliselt kaugemate liikide puhul. Looduslikult kompetentsetes bakterites on olemas geenikomplektid, mis kodeerivad DNA transmembraanseks transpordiks vajalikke valke, näiteks DNA translokaasi komplekse tsytoplasmamembraanis ja tyyp IV kiudude kokkupanekuks tarvilikke valke.

Tulenevalt Gram-positiivsete ja Gram-negatiivsete bakterite rakukesta erinevustest esineb mõningaid erinevusi viisis, kuidas täpselt bakterid rakuvälist DNA-d enda sisse toovad, kuid yldjoontes on protsess siiski sarnane. Esmalt seondub DNA kompetentse raku pinnal paiknevale DNA retseptorile ning liigub DNA translokaasi abil läbi rakumembraani. Selle käigus lagundatakse selle yks ahel nukleaaside poolt, kuna rakku pääseb vaid yheahelaline DNA. Sellist yheahelalist DNA-d on RecA ehk rekombinaas A abil võimalik genoomi integreerida. Gram-negatiivsed bakterid vajavad oma rakukesta mitmekihilise ehituse tõttu valgulist kanalit ka välisesse membraani, mille moodustavad sekretiinid. Arvatakse ka, et oma roll on piliinil, kuid selle funktsiooni kohta pole veel kuigi palju teada. DNA transport rakku pole enamasti järjestuse-spetsiifiline, ent mõnede liikide puhul võivad kindlad järjestused rakuvälises DNA-s seda kergendada.

Kunstlik kompetentsus

Kunstliku kompetentsuse tekitamiseks on kaks enamlevinud meetodit: elektroporatsioon ja rakkude manipuleerimine temperatuuri ning soolalahuse abil. Mõlemad neist muudavad rakuseina DNA-le passiivselt läbitavaks looduses harilikult mitteilmnevate keskkonnategurite mõjul.

Elektroporatsiooni käigus antakse bakterirakkude lahusele, kuhu on lisatud soovitav plasmiid, elektrilöök, mis perforeerib nende rakuseina, et plasmiidne DNA siseneda saaks. Peale elektriväljale eksponeerimist parandavad raku membraaniparandusmehhanismid augud taas väledasti ära. Tegu on rakusõbralikuma meetodiga kui soolalahuse kasutamine, kuna rakud viibivad stressitekitavates tingimustes palju lyhemat aega. Kasutatava elektrivälja tugevus jääb tavaliselt vahemikku 10-20 kV/cm.

Keemilisi kompetente hoitakse mõnda aega jää peal kahevalentsete katioonidega soolalahuses, enamasti on selleks kaltsiumkloriidi lahus, misjärel vapustatakse neid kiire lyhiajalise kuumutamisega. Arvatakse, et soolalahuse positiivsed ioonid aitavad bakterikesta negatiivselt laetud pinnamolekule neutraliseerida, muutmaks membraani negatiivselt laetud DNA jaoks paremini läbitavaks. Kuumašokk on vajalik selleks, et tekitada temperatuurierinevus raku sise- ja väliskeskkonnas, mis sunnib DNA läbi kahjustatud membraani rakku sisenema.

Taimed

DNA viimiseks taimedesse on mitmeid mehhanisme. Lihtsaim neist on transformatsioon Agrobacterium tumefaciensi abil. Selleks lõigatakse taime kude, milleks tavaliselt on leht, väikesteks tykkideks ja leotatakse umbes kymme minutit Agrobacteriumi sisaldavas suspensioonis. Servmised rakud, mis asuvad lõikepinnal, saavad bakteri poolt transformeeritud. Kui selliselt töödeldud koetykid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel yles kasvatada, saadakse geneetiliselt teisenenud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele kylvata. Paljusid taimeliike antud meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Väga suur osa taimedes on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembryosse. Efektiivsus on sel meetodil kyll madalam kui Agrobacteriumi kasutades, kuid võimalike mõjustatavate taimede valik on oluliselt laiem. Samuti on suureks eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsion, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.

Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete taimeviiruste abil, kuid see pole transformatsioon vaid transduktsioon - rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal tsytoplasmas replitseerub, siis enamasti saab sel moel mõjustada vaid yht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestet geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised kromosoomidega rekombineeruma, tekitades taime genoomis pysivaid muutusi, mistõttu kandub selline ymberkorraldus yle ka järglastele.

Loomad

DNA viimist loomsetesse rakkudesse nimetatakse harilikult transfekrsiooniks. Ka sel puhul muudetakse rakusein erinevate võtete abil auklikuks, et soovitud materjal rakku liikuda saaks. Transfektsioon ei tähenda ainult DNA viimist rakku, selleks võib olla näiteks siRNA konstrukt või valk nagu antikeha. Transfekteerimiseks kasutatakse kaltsiumfosfaati, elektroporatsiooni või segatakse rakku viidav aine katioonsete lipiididega moodustamaks liposoome, mis membraaniga kokku sulades sisaldise rakku viivad.


Praktilisi kylgi molekulaarbioloogias

Kunstliku kompetentsuse tekitamine bakterites annab hea võimaluse DNAga manipuleerimiseks ja valkude ekspressiooniks. Levinuimaks mudelorganismiks on Escherichia coli, keda enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku pysimajäämiseks olema oma replikatsiooni alguspunkt, et teda genoomist sõltumatult paljundada saaks. Transformatsiooniefektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d yles korjavad, mõõtyhikuks on CFU/μg DNA kohta. CFU ehk colony forming units väljendab eluvõimeliste rakkude hulka näites milliliitris lahuses. Väikese plasmiidi nagu pUC19 puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1x108 cfu/μg seda, et umbes 1 plasmiid 2000 hulgast läheb rakku sisse. Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal kylmas CaCl2 lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42°C juures sõltuvalt metoodikast 30-120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks keskmiselt 106 - 107 transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.

Transformatsiooni efektiivsus väheneb plasmiidi suuruse kasvades, mistõttu kasutatakse suuremate plasmiidide ja kosmiidide puhul elektroporatsiooni. Elektroporeeritavaid rakke on enne töötlust soovitatav pesta kylma mitmekordselt destilleeritud veega, eemaldamaks laetud osakesi, mis protsessi käigus sädet anda võiksid.