BacMam-süsteem

Allikas: Vikipeedia
Inimese multipotentne rakk (MSC) ekspresseerimas mikrotuubulitega seostunud liitvalgu rohelist fluorestseeruvat valku histoon 2b sulandumise punasesse tagRFP-sse läbi BacMam geeni toimetamise meetodi

BacMam-süsteemiks nimetatakse bakuloviiruse (Baculovirus) geeni ülekannet imetajarakkudesse [1][2]. Termin "BacMam" tuleneb ingliskeelse fraasi kahe sõna esitähtedest: "Baculovirus gene transfer into Mammalian cells" ja seda terminit kasutatakse teemakohastes teadusartiklites.

Bakuloviirused on putukarakkudes paljunevad DNA-viirused, mis modifitseerituna on võimelised ekspresseerima imetajarakkudes valke. BacMam-süsteem kasutab modifitseeritud putukaraku viirust (bakuloviirust) transpordivahendina, et viia geene imetajarakkudesse minimaalse lisaainete koguse ja toksilisusega. Tehnoloogia põhineb sellel, et bakuloviiruse genoomi viiakse kassett imetajarakkudes ekspresseeritavate valkude geenidega. Kuna putukaviirused imetajaterakkudes ei paljune, puudub ka igasugune nakkusoht inimestele ja keskkonnale.

BacMam-süsteem on bakuloviiruse-vahendatud geeni toimetamise meetod, mille avastas ning töötas välja Dr. Frederick M. Boyce. Oma paljude eeliste tõttu teiste transfektsiooni meetodite ees, on BacMam-tehnoloogia tänaseks juba laialdast kasutust leidnud [3][4][5]. Peale selle esineb BacMam-süsteemil sisemine paindlikkus stabiilsete rakuliinide üle[6], mistõttu võib antud meetodit nimetada ka standardseks geeni toimetamise tehnoloogiaks.

Üldised omadused[muuda | redigeeri lähteteksti]

BacMam-süsteemi geeni kättetoimetamise tehnoloogia on transientne ekspressiooni süsteem, mis hõlbustab toksiliste geeniproduktide ekspressiooni. See hõlmab laia transduktsiooni ulatuse, sealhulgas ka erinevaid algraku tüüpe ja tüvirakke.[7] Bakuloviiruslikul genoomil on suur võime võõraste geenide sisseviimiseks, mis on edukalt saavutatud alates geenidest suurusega 38 kiloaluspaari.[8] Teostatav on ka samaaegne mitmekordne geeni ülekanne samasse rakku.[9] Mikroskoopiliselt vaadeldavaid tsütopatoloogilisi BacMam-süsteemi osakeste efekte imetajarakkudes on väga vähe.[10] Geeniekspressiooni tase võib olla kohandatud viirusliku annuse või keemiliste lisandite poolt, kasutades histooni deatsetülaasi inhibiitorit.[11] Rakkude transduktsiooni teostatakse ainult lahuse lisamise teel ja seetõttu on BacMam-süsteem ka järeleandlik automatiseeritud meetod. Viirusosakesed jäävad lõpuks stabiilseks, kui neid hoida pimedas pika ajavahemiku jooksul 4 °C juures.[12]

Tehnoloogia ülevaade[muuda | redigeeri lähteteksti]

BacMam-tehnoloogia baseerub putukaviiruse kaksikhelikaalsel DNA-l kui transpordivahendil efektiivseks geeniülekandeks ning geenide ekspresseerumiseks imetajarakkudes. BacMam-reagente (valik reagente:[13]) kasutatakse rakupõhistel analüüsidel, elusrakkude uurimisel, tüvirakkude bioloogias ja paljudes teistes rakendustes.

Geenide ülekandmiseks imetajarakkudesse kasutatakse standardset transduktsiooni protsessi. BacMam-süsteemi osakesed viiakse endotsütoosi ja vabastatakse transkriptsiooni ja geeniekspressiooni ajal. Transduktsiooni puhul kannavad geene edasi viirused. Paljud viirused liidavad rakku sisenedes oma DNA peremeesraku genoomi ning genoomist lahkudes ja rakust väljudes võtavad koos oma genoomiga kaasa ka peremehe geene. Uude peremeesrakku sisenedes on neil niiviisi kaasas eelmise peremehe geenid ja need võivad uues peremehes alles jääda ning toimima hakata.[14] Geeniekspressioon algab 4 kuni 6 tunni jooksul transduktsiooni ajal ning paljude rakutüüpide puhul lõppeb täielikult alles pärast üleööd. Sõltudes transduktsiooni efektiivsusest, rakutüübist ja rakujagunemise määrast, jääb transgeen märgatavaks 5–14 päevaks.[15]

Eelised[muuda | redigeeri lähteteksti]

  • Tõhus imetaja rakuliinide transduktioon.
  • BacMam reagente saab kasutada väga laias imetaja rakutüüpide vahemikus. Rakutüübid, mis on edukalt transdukteeritud BacMam-reagentidega, hõlmavad arvukaid transformeeritud rakuliine (näiteks U2-OS, HEK 293 ning HeLa). Paljude algrakkude (näiteks fibroblastid, hepatotsüüdid, kardiovaskulaarsed rakud ja epiteelrakud) ja tüvirakkude (näiteks närvirakud ja mesenkemaalid) transformeeritud rakuliinide BacMam transduktsioon on näidanud kõrget tõhusust ning üldiselt pole täheldatud ka vastumõjusid. See teeb antud platvormi väga paljutõotavaks geeni toimetamise tehnoloogiaks.[16]
  • Ohutu – ei replitseeru imetajarakkudes, ja märgatava tsütopaatse efekti puudumine.
  • Eeltransdukteeritud rakkude hoiustamine külmutatult genereerib analüüsiks valmisrakke.
  • Analüüsi arengu kiirus – puudub vajadus tekitamaks stabiilseid rakuliine.

Bioohutusalased kaalutlused[muuda | redigeeri lähteteksti]

Bakuloviirused on esimese riskigrupi esindajad, mida on laialdaselt kasutatud juba üle 25 aasta putukarakkude valgu ekspressiooni rakendamiseks.[17] Bakuloviirused on loodud putukarakkudes ja on võimetud paljunema imetajarakkudes ning ei ole teada ka ühtegi haigust, mille põhjustajaks tervetele täiskasvanud inimestele võiksid nad olla. Lisaks on BacMam viirusosakesed inaktiveeritud inimese poolt, mis vähendab riski teaduritele. Peale selle ei saa viirused paljuneda ka putukates, mistõttu puudub igasugune oht keskkonnale.[18][19]

Viiruslik sisenemine[muuda | redigeeri lähteteksti]

Uuringud bakuloviiruse sisenemisel inimese hepatotsellulaarsetesse vähkkasvaja rakkudesse vihjavad sellele, et BacMam siseneb imetajarakkudesse läbi klatriin-vahendatud endotsütoosi ning võimalikult läbi makropinotsütoosi .[20] Hilisemad uuringud on vihjanud ka spetsialiseerunud lipiidiparve – caveolae, mis omab mitmeid signaaliülekande funktsioone, kaasamisest bakuloviiruse sisenemisse imetajarakkudesse.[21]

Peremeesraku vastus[muuda | redigeeri lähteteksti]

Et tehnoloogia toimiks efektiivselt, siis geeni toimetamise meetod ei tohi normaalseid rakulisi funktsioone segama hakata.Tsütotoksilisuse hinnangud ning transkriptsiooni analüüsid inimese HEK rakuliinidel (HEK293) on näidanud, et bakuloviiruse transduktsioon ei ole tsütotoksiline ega põhjusta muutusi transkriptsioonilistes vastustes.[22] Samamoodi nakatunud Schwanni rakud säilitavad omale iseloomuliku morfoloogilise ja molekulaarse fenotüübi ja on võimelised diferentseeruma katseklaasis ja ekspresseerima P0 müeliinisatsiooni markerit. Kasutades komplementaarse DNA (cDNA) mikrorivi tehnoloogiat, et kontrollida in vitro (katseklaasis) ja in vivo (elusas rakus/organismis) üldist rakulist geeni väljenduse profiile roti ajus, aretatud inimese astrosaite ning inimese närvirakke pärast viiruslikku transduktsiooni, on täheldatud peremehe antiviiruslik vastus.[23] Suguluses olevad geenid on peamiselt need, mis on seotud kaasasündinud immuunsusega, kaasa arvatud erinevad geenid, olles kaasatud nuku-laadse retseptori signaaliülekandesse ja tsütokiin-tsütokiin retseptori interaktsiooni.

Rakendused[muuda | redigeeri lähteteksti]

  • Bioproduktsioon
BacMam-süsteemi on kasutatud tootmaks valke suurtes kogustes, kasutades HEK293 rakke õõneskiud-bioreaktori süsteemis.[24]
  • Kõrgläbilaske linastus
G-valguga seotud retseptori farmakoloogia on võimaldanud tänu BacMam-süsteemi tehnoloogiale avastatud ravimite rakendust.[25]
  • Fluorestsentsmikroskoopia
Organellide märgistamise reagentidena on kaubanduses saadaval BacMam organellide ja teiste rakusiseste struktuuride märgistuspartiklid.[26]
Üksik-mitokonder-märgistatud mitokondriaalselt suunatud roheline fluorestseeruv valk.[27]
  • Retseptor aktivatsiooni/ käiguraja analüüs
Serotoniini retseptori aktivatsiooni iseloomustus läbi BacMam-süsteemi poolt kohale toimetatud fusiooni kinaasi substraati.[28]

BacMam-viiruste kasutamine südamehaiguste raviks[muuda | redigeeri lähteteksti]

Geneetiliselt muundatud kardiomüoblastide ehk südamelihasrakkude võime ravida kahjustatud südamelihast on hästi teada. Siiski on ravimisel suureks probleemiks selliste rakkude efektiivne ülekanne. Piiravaks faktoriks on massiivsed rakkude surmad pärast nende lihasrakkude-välist siirdamist verd-pumpavasse südamesse. Selle probleemi adresseerimiseks on loodud rekombinantsed bakuloviirused (BacMam-viirused), mis transdukteerivad efektiivselt südamelihasrakke optimiseeritud tingimustes. Need geneetiliselt modifitseeritud rakud jäävad kaitstuks uue polümeerse mikrokapsli tekke tõttu, mistõttu rakud säilitavad elujõulisuse. See toetab rakkude kiiret levikut vähemalt 30-ks päevaks. Antud kapslid omavad tugevat immuunkaitset ning rohkem kui 70%-l tervetel kapslitel on kõrge mehhaaniline ja osmootne stabiilsus. Siiski on vaja teha kliinilisi uuringuid, et teada selle pikaajalisi mõjusid. Uuringutes loodi rekombinantsed viirused BacMam-süsteemi kasutades. See on tõhus tööriist erinevate geeniteraapiate rakendamiseks, kuna see kombineerib laialdase rakkude kasvamise ning kõrge efektiivsusega transientse transgeeni avaldumise. Kuigi rekombinantset bakuloviirust võib pidada teatud mõttes süsteemi võlaks, on see siiski soovitum tunnus, arvestades selle bioohutust. Transientne ekspressioon on tunnuseks loodusliku mehhanismi puudumisel bakuloviiruse integreerumisel peremeesraku genoomiga. Kui alade tõttu, kus teiste imetaja viiruste nagu adenoviiruste ja lentiviiruste (nt HIV1, HIV2, SIV jt) vektoritel on suur tõenäosus juhuslikuks liitumiskes peremehe spetsiifilisse genoomi regiooni, võib esineda tahtmatute kasvajate teket, siis bakuloviirusega on selline oht võimalikult madal. Seetõttu kasutatakse just bakuloviiruseid geenide ülekandmiseks, kuna tagatud on bioloogiline ohutus.[29]

Viited[muuda | redigeeri lähteteksti]

  1. Hofmann, C; Strauss, M (1998). "Baculovirus-mediated gene transfer in the presence of human serum or blood facilitated by inhibition of the complement system". Gene Therapy 5 (4): 531–536. 
  2. Boyce, FM; Bucher, NL (1996). "Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93 (6): 2348–52. 
  3. Kost, T; Condreay, JP (2002). "Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors". Trends in Biotechnology 20 (4): 173–180. 
  4. Kost, Thomas A; Condreay, J Patrick; Jarvis, Donald L (2005). "Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells". Nature Biotechnology 23 (5): 567–575. 
  5. Kost, T; Condreay, J; Ames, R; Rees, S; Romanos, M (2007). "Implementation of BacMam virus gene delivery technology in a drug discovery setting". Drug Discovery Today 12 (9–10): 396–403. 
  6. Davenport, Elizabeth A.; Nuthulaganti, Parvathi; Ames, Robert S. (2009). "BacMam: Versatile Gene Delivery Technology for GPCR Assays". Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 552: 199–211. 
  7. Zeng, Jieming; Du, Juan; Zhao, Ying; Palanisamy, Nallasivam; Wang, Shu (2007). "Baculoviral Vector-Mediated Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells". Stem Cells 25 (4): 1055–1061. 
  8. Cheshenko, N; Krougliak, N; Eisensmith, R C; Krougliak, V A (2001). "A novel system for the production of fully deleted adenovirus vectors that does not require helper adenovirus". Gene Therapy 8 (11): 846–854. 
  9. Ames, Robert; Nuthulaganti, Parvathi; Fornwald, Jim; Shabon, Usman; Van-Der-Keyl, Harjeet; Elshourbagy, Nabil (2004). "Heterologous Expression of G Protein?Coupled Receptors in U-2 OS Osteosarcoma Cells". Receptors and Channels 10 (3–4): 117–124. 
  10. Cheng, T; Xu, CY; Wang, YB; Chen, M; Wu, T; Zhang, J; Xia, NS (2004). "A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus". World journal of gastroenterology : WJG 10 (11): 1612–8. PMID 15162535. 
  11. Pfohl, JL; Worley Jf, 3rd; Condreay, JP; An, G; Apolito, CJ; Kost, TA; Truax, JF (2002). "Titration of KATP channel expression in mammalian cells utilizing recombinant baculovirus transduction". Receptors & channels 8 (2): 99–111. PMID 12448791. 
  12. Jorio, H.; Tran, R.; Kamen, A. (2006). "Stability of Serum-Free and Purified Baculovirus Stocks under Various Storage Conditions". Biotechnology Progress 22 (1): 319–325. 
  13. "BacMam reagents"
  14. (2009) "Horisontaalne geeniülekanne" Eesti Loodus T. Tenson
  15. "BacMam Technology Overview"
  16. "BacMam Compatible Cells"
  17. Smith, GE; Summers, MD; Fraser, MJ (1983). "Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector". Molecular and cellular biology 3 (12): 2156–65. 
  18. Kost, T. A., and Condreay, J. P. 2002a. Applied Biosafety 7:167–169.
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., and Mickelson, C. A. 2000. Bisafety and viral gene transfer vectors. In Biological safety, principles and practices, 3rd ed. D. O. Fleming and D. L. Hunt (eds.), American Society for Microbiology Press, Washington D.C., pp. 579–597.
  20. Matilainen, H.; Rinne, J.; Gilbert, L.; Marjomaki, V.; Reunanen, H.; Oker-Blom, C. (2005). "Baculovirus Entry into Human Hepatoma Cells". Journal of Virology 79 (24): 15452–15459. 
  21. Long, G.; Pan, X.; Kormelink, R.; Vlak, J. M. (2006). "Functional Entry of Baculovirus into Insect and Mammalian Cells is Dependent on Clathrin-Mediated Endocytosis". Journal of Virology 80 (17): 8830–8833. PMC 1563848. 
  22. Kenoutis, C.; Efrose, R. C.; Swevers, L.; Lavdas, A. A.; Gaitanou, M.; Matsas, R.; Iatrou, K. (2006). "Baculovirus-Mediated Gene Delivery into Mammalian Cells Does Not Alter Their Transcriptional and Differentiating Potential but is Accompanied by Early Viral Gene Expression". Journal of Virology 80 (8): 4135–4146. 
  23. Boulaire, Jérôme; Zhao, Ying; Wang, Shu (2009). "Gene expression profiling to define host response to baculoviral transduction in the brain". Journal of Neurochemistry 109 (5): 1203–1214. 
  24. Jardin, B; Zhao, Y; Selvaraj, M; Montes, J; Tran, R; Prakash, S; Elias, C (2008). "Expression of SEAP (secreted alkaline phosphatase) by baculovirus mediated transduction of HEK 293 cells in a hollow fiber bioreactor system". Journal of Biotechnology 135 (3): 272–280. 
  25. Ames, Robert; Fornwald, James; Nuthulaganti, Parvathi; Trill, John; Foley, James; Buckley, Peter; Kost, Thomas; Wu, Zining et al. (2004). "BacMam Recombinant Baculoviruses in G Protein?Coupled Receptor Drug Discovery". Receptors and Channels 10 (3–4): 99–107. 
  26. Ames, Robert S. et al.'; Kost, Thomas A; Condreay, J Patrick (2007). "BacMam technology and its application to drug discovery". Expert Opin. Drug Discov 2 (12): 1669–1681. 
  27. Distelmaier, Felix; Koopman, Werner J. H.; Testa, Epifania R.; De Jong, Arjan S.; Swarts, Herman G.; Mayatepek, Ertan; Smeitink, Jan A. M.; Willems, Peter H. G. M. (2008). "Life cell quantification of mitochondrial membrane potential at the single organelle level". Cytometry Part A 73A (2): 129–138. 
  28. Huwiler, Kristin G.; MacHleidt, Thomas; Chase, Lucas; Hanson, Bonnie; Robers, Matthew B. (2009). "Characterization of serotonin 5-hydroxytryptamine-1A receptor activation using a phospho-extracellular-signal regulated kinase 2 sensor". Analytical Biochemistry 393 (1): 95–104. 
  29. (2010)"BacMam Virus Transduced Cardiomyoblasts Can Be Used for Myocardial Transplantation Using AP-PEG-A Microcapsules: Molecular Cloning, Preparation, and In Vitro Analysis" Journal of Biomed Biotehn